KR20180023212A

KR20180023212A - 겨울우산버섯으로부터 세스퀴테르펜의 생산방법

Info

Publication number: KR20180023212A
Application number: KR1020160108148A
Authority: KR
Inventors: 김명길; 이성숙; 유선화; 이수연
Original assignee: 대한민국(산림청 국립산림과학원장)
Priority date: 2016-08-25
Filing date: 2016-08-25
Publication date: 2018-03-07
Also published as: KR101839996B1

Abstract

본 발명은 마그네슘을 포함하는 배지에서 겨울우산버섯을 배양하여, 이소펜테닐2인산 이성화효소(isopentenyl diphosphate isomerase)를 코딩하는 유전자, 파르네실 2인산 합성효소(farnesyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자 및 세스퀴테르펜 합성효소(sesquiterpene synthase)를 코딩하는 유전자의 발현량을 증대시킴으로써, 세스퀴테르펜을 고수율로 대량 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

Description

겨울우산버섯으로부터 세스퀴테르펜의 생산방법{Method for mass production of sesquiterpene from Polyporus brumalis}

본 발명은 겨울우산버섯으로부터 세스퀴테르펜(sesquiterpene)의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 마그네슘을 포함하는 배지에서 겨울우산버섯을 배양하여, 이소펜테닐2인산 이성화효소(isopentenyl diphosphate isomerase)를 코딩하는 유전자, 파르네실 2인산 합성효소(farnesyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자 및 세스퀴테르펜 합성효소(sesquiterpene synthase)를 코딩하는 유전자의 발현량을 증대시킴으로써, 세스퀴테르펜을 고수율로 대량 생산할 수 있는 방법에 관한 것이다.

미생물은 다양한 이차 대사산물을 생성하고, 버섯 분류에 속하는 목재 부후균은 나무에 기생하며 다양한 이차 대사산물을 생성하는 것으로 알려져 있다.

겨울우산버섯(Polyporus brumalis)은 균사체로부터 특정 세스퀴테르펜 (유데스몰, eudesmol) 성분들을 생합성하는 능력을 지니고 있다. 특히 세스퀴테르펜(sesquiterpene) 화합물에 속하는 유데스몰은 기존 식물에서도 생합성되는 테르펜 성분으로 유해 진균에 대한 항진균 활성 (anti-fungal activity) 뿐만 아니라, 염증 인자의 발현을 감소(항염증, anti-inflammatory)시키는 중요 생리 활성 물질로 알려져 있다.

현재 미생물로부터 분리한 2차 대사산물은 약 16,500 여종인데, 주로 방선균 유래 (62%), 곰팡이 유래(20%), 세균 유래(18%)로서, 버섯과 담자균 유래의 생리활성 물질 분리는 그 비율이 극히 적은 실정으로서, 새로운 자원의 개발이 절실히 요구되고 있다.

우리나라에 자생하는 버섯의 종류는 약 1,500여종이 알려져 있으나, 그 중 극히 일부인 십여 수종이 식용이나 약용 버섯으로 사용되고 있다.

그러나, 몇몇 버섯으로부터 항생 물질(antibiotic), 항암 물질(antitumor), 항바이러스 물질(antivirus)과 같은 다양한 생리활성 물질 등이 발견되어 식용이 아니더라도 잠재적인 농산업 자원으로서의 가치를 갖는다.

버섯을 포함하는 균류는 생장 과정 중에 다양한 성분의 물질을 합성, 분비 및 축적한다. 1차 대사산물로 단백질, 다당류, 유기산, 비타민, 지방 등의 영양 성분이 있으며, 2차 대사산물로는 항암 물질, 항생 물질, 테르페노이드(terpenoid) 류 및 톡신(toxin) 등의 약리활성 성분들이 있다.

버섯에 함유된 생리활성 물질에 관한 연구는 식물에 비해 아직 미개척 분야지만, 미생물로서의 자원이 풍부하기 때문에 신물질 창출을 위한 중요한 자원으로 이용할 수 있다.

한편, 생강으로부터 세스퀴테르펜의 일종인 베타 세스퀴테르펜(ß-eudesmol) 등의 추출방법 (Korean J. Food & Nutr. Vol.13, No.1. 66~70 (2000)), 흰씀바귀로부터 추출된 세스퀴테르펜 락톤 화합물을 함유하는 심혈관 질환 및 암 치료용 조성물 (한국공개특허 제10-2004-0070985호), 실측백나무속으로부터 추출한 세스퀴테르펜 유도체를 포함하는 고지혈증, 지방간, 당뇨 또는 비만의 예방 또는 치료용 조성물 (한국등록특허 제10-0905419호) 등이 개시되어 있다.

그러나, 상기 종래기술에 의한 세스퀴테르펜계 화합물의 유래는 식물로서, 이러한 식물 내의 성분을 생산하기 위해서는 식물로부터의 잎 채취, 증기 증류법에 의한 정유 추출, 크로마토그래피 원리에 의한 분획(separation) 및 단리(purification) 등의 복잡한 단계적 과정을 거쳐야 얻을 수 있으나, 식물에 포함되어 있는 세스퀴테르펜계 화합물의 양 자체가 소량이기 때문에, 이용에 제한이 따른다.

이에 버섯으로부터 유데스몰 등과 같은 세스퀴테르펜(sesquiterpene)의 대량 생산방법의 개발이 요구되고 있는 실정이다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 연구를 지속적으로 수행하여, 버섯, 특히 겨울우산버섯의 균사체를 특정 조건에서 배양함으로써, 세스퀴테르펜의 대량 생산이 가능함을 알아내고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 겨울우산버섯으로부터 특정 성분을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함함으로써, 세스퀴테르펜을 대량 생산할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 마그네슘을 포함하는 배지에서 겨울우산버섯을 배양하여, 이소펜테닐2인산 이성화효소(isopentenyl diphosphate isomerase)를 코딩하는 유전자, 파르네실 2인산 합성효소(farnesyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자 및 세스퀴테르펜 합성효소(sesquiterpene synthase)를 코딩하는 유전자의 발현량을 증대시키는 단계를 포함하는 세스퀴테르펜의 생산방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기의 방법에 의해 생산된 세스퀴테르펜을 제공한다.

본 발명에 의한 세스퀴테르펜의 대량 생산방법은 특이적인 배양 조건, 즉 마그네슘을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 겨울우산버섯의 균사 배양액으로부터 세스퀴테르펜을 효율적으로 대량 생산할 수 있는 장점을 지닌다.

또한, 기존의 백색 부후균으로부터 생성되는 이차 대사산물에 관한 연구가 극히 드문 점을 감안할 때, 천연물 생산을 위한 새로운 미생물 자원으로서의 가치를 지니고 있다.

도 1은 MgSO4 미포함 배지에서의 산물 분석(GC MS)결과를 나타낸 것이다.
도 2는 두 피크(RT:26.90분과 RT:35.51분)의 매스(mass) 패턴을 나타낸 것이다.
도 3은 MgSO4 포함 배지에서의 산물 분석(GC MS)결과를 나타낸 것이다.
도 4는 두 피크(RT:35.70분과 RT:39.90분)의 매스(mass) 패턴을 나타낸 것이다.
도 5는 메발론산 경로를 나타낸 것이다.
도 6a는 두 조건(마그네슘 포함 배지, 마그네슘 미포함 배지)에서의 배양 5일째에 9개 유전자의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 것이고, 도 6b는 두 조건(마그네슘 포함 배지, 마그네슘 미포함 배지)에서의 배양 7일째에 9개 유전자의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 것이며, 도 6c는 두 조건(마그네슘 포함 배지, 마그네슘 미포함 배지)에서의 배양 12일째에 9개 유전자의 발현량을 비교한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명은 마그네슘을 포함하는 배지에서 겨울우산버섯을 배양하여, 이소펜테닐2인산 이성화효소(isopentenyl diphosphate isomerase)를 코딩하는 유전자, 파르네실 2인산 합성효소(farneyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자 및 세스퀴테르펜 합성효소(sesquiterpene synthase)를 코딩하는 유전자의 발현량을 증대시키는 단계를 포함하는 세스퀴테르펜의 생산방법에 관한 것이다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 이소펜테닐2인산 이성화효소는 하기 메발론산 경로의 Enzyme 7인 것을 특징으로 한다.

[메발론산 경로]

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 파르네실 2인산 합성효소는 상기 메발론산 경로의 Enzyme 8인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 세스퀴테르펜 합성효소는 상기 메발론산 경로의 Enzyme 9인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 배지는 증류수 1L 당, 글루코스 10g, 암모늄 타르트레이트 0.2g, 마그네슘 설페이트 0.5g, 칼슘 클로라이드 0.1g을 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 배지는 상기 성분 이외에 망간, 철, 코발트, 아연, 구리 등으로부터 선택되는 저농도 원소(minor elements) 및 비타민과 같은 증식 필수인자(growth factor)를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 배지의 pH는 3.5~4.5,일 수 있다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 겨울우산버섯을 배양하는 단계는 포테이토 덱스트로스 아가(PDA) 배지에서 전배양한 겨울우산버섯의 균사를 상기 배지에 접종한 후, 진탕배양하는 단계를 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 PDA 배지는 일반적으로 곰팡이와 같은 진균을 증식하는데 적합한 배지로 알려져 있으며, 특히 감자 등과 같은 탄소원이 풍부한 배지이다.

일반적으로 곰팡이와 같은 진균을 배양하기 위해서는 진탕 배양기(shaker incubator) 또는 정치 배양기(stationary incubator)를 사용할 수 있는데, 정치 배양은 가만히 놓아 둔 상태에서 미생물을 증식시키는 방법이며, 진탕 배양은 산소 공급에 효율성을 높여주는 방법으로서, 정치 배양에 비해 산소 공급이 원활하게 이뤄질 수 있는 장점을 갖는다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 배양은 25~30℃의 온도 및 50~150 rpm의 조건으로 5~15일 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법에서, 상기 배양은 28℃의 온도 및 100 rpm의 조건으로 12일 동안 수행할 수 있다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산방법은 상기 겨울우산버섯을 배양하는 단계의 종료 후에, 상기 겨울우산버섯의 균사 배양액에 유기 용매를 첨가하여 진탕 추출한 다음, 농축하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산 방법에서, 상기 균사 배양액에 염화나트륨을 첨가한 후, 유기 용매를 첨가하여 진탕 추출할 수 있는데, 그 이유는 세스퀴테르펜의 추출 효율을 높이기 위함이다.

본 발명의 상기 세스퀴테르펜의 생산 방법에서, 상기 유기 용매는 에틸아세테이트일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 유기 용매는 필요에 따라 다양하게 변화시킬 수 있다.

또한, 본 발명은 방법에 의해 생산된 세스퀴테르펜에 관한 것이다.

세스퀴테르펜은 편백과 삼나무 정유에 포함되어 있는 성분으로서, 피부 진균(dermatophytes)이나 호흡기 질환 박테리아(respiratory track bacteria)에 대한 항미생물 활성(antimicrobial activity)이다.

또한, 세스퀴테르펜은 세스퀴테르펜 알코올 화합물로서, 알코올 관능기를 포함하고 있으며, 각종 생리활성에 관한 연구들이 보고된 바 있고, 항종양 활성을 나타낸다고도 알려져 있다.

한편, 세스퀴테르펜은 삼나무나 편백 정유의 주요 활성성분으로 알려져 있으며, 항진균 활성을 나타내는데, 특히, 무좀을 유발하고 백선을 유발하는 피부 진균(dermatophytes)에 속하는 Trichophytons 속 균주에 대해 항균 활성을 나타낸다고 알려져 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예>

이하의 실시예에서는 세스퀴테르펜 성분이 겨울우산버섯으로부터 생성되는 메커니즘을 이해하고, 균사체로부터 발현되는 전사체를 분석하여 생성에 관련된 유전자 정보를 확인하고자 하였다.

특히, 세스퀴테르펜 성분들의 생성되는 조건과 생성되지 않는 조건을 구명하고, 두 조건에서의 목적 유전자들의 발현양상 비교(differentially expressed genes; DEGs)를 수행하였다.

1. 재료 및 방법

(1). 균주의 배양

겨울우산버섯(Polyporus brumalis)은 국립산림과학원(national institute of forest science)에서 배양받은 균주를 이용하였으며, PDA (Potato Dextrose agar)배지에서 10일간 전배양(pre-cultivation)한 후, 균체만 긁어 내어 멸균 증류수와 함께 균질화(homogenizing) 하였다.

균질화(마쇄된)된 균체액은 전조하여 전건 기준으로 배지 100 ml에 균사량을 0.1% 접종하고 28℃에서 100 rpm으로 진탕하면서 5일, 7일, 12일간 배양하였다.

균주의 배양은 크게 두 가지 조건(MgSO₄ 포함 및 MgSO₄ 미포함)에서 수행하였으며, 상기 두 조건의 배양액 조성은 하기의 표 1과 같다.

(2). 대사 산물의 분석

겨울우산 균사로부터 생성되는 유용 대사산물 분석을 위해 일정 기간 배양한 배양액은 원심분리를 통해 균사와 배양액으로 분리하였고, 배양액은 다시 유기용매 (에틸아세테이트)로 추출하였다.

각 배양 일수별로 분리된 배양액 추출물은 증발기(evaporate)를 이용하여 완전히 농축한 후, 최종 볼륨을 2 ml로 동일하게 맞추어 성분 분석을 위한 시료 준비를 완료하였다.

각 성분의 분석은 휘발성분 분석에 적합한 가스크로마토그래피(GC MS)를 이용하였다. 분석 조건은 인젝터 260℃, 디텍터 280℃로 하고, 검출된 피크의 질량 패턴(mass pattern)은 National Institute of Standards Technology 2005 library와 비교분석하였다.

(3). 테르펜 합성 관련 유전자 발현 분석

(3-1). DNA 추출

곱게 마쇄된 각 샘플은 DNA extraction buffer (Tris-HCl, NaCl, EDTA, SDS, distilled water) 300 ml에 섞어 보텍싱하였다. 이를 다시 원심분리 (13,000 rpm, 15 min, 4℃)하여 상층액만 분리하였다.

분리된 상층액은 250 ㎕의 페놀-클로로포름-아이소아밀 알코올(phenol-chloroform-isoamyl alcohol)과 섞어주었다. 이 과정을 한 번 더 동일하게 수행하여 분리된 상층액은 500 ㎕의 95% 에탄올과 섞어 주었다. 섞은 용액은 원심 분리하여 에탄올을 제거하고, RNAse로 RNA를 제거한 다음, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 최종 DNA를 획득하였다.

(3-2). RNA 추출

상기 (1)의 균주 배양에서 얻은 배양액과 분리된 균사는 유전자 발현 분석을 위해 사용되었다. 각 배양 일수별로 회수된 균사를 액체 질소를 이용하여 마쇄한 후, RNA 추출 키트(NucleoSpin@ RNA Plant kit)를 이용하여 RNA를 분리하였다.

350 ㎕의 용해 용액(lysis buffer)을 넣어 마쇄된 균사의 세포벽을 녹이고, NucleoSipn Filter로 거른 후, 70% 에탄올 350 ㎕을 첨가하여 RNA를 침전시켰다. 이것을 NucleoSpin RNA Plant Column에 통과시켜 RNA를 칼럼의 실리카 박막(silica membrane)에 결합(binding)시켰다.

350 ㎕의 MDB(Membrane Desalting Buffer)로 RNA가 결합되어 있는 칼럼에 통과시켜 실리카 박막에서 분리(desalting)하였다.

DNA를 분해하기 위해 95 ㎕의 rDNase 반응 혼합물을 칼럼에 첨가하여 실온에 15분 정치시킨 후, 칼럼을 세척 용액(washing buffer)으로 200 ㎕, 600 ㎕, 250 ㎕씩 3회 세척하였다.

원심분리기를 이용하여 세척 용액의 알코올 성분을 완전히 증발시킨 후, 40 ㎕의 RNase-free water를 칼럼에 첨가한 후 RNA를 회수하였다.

상기에서 분리한 RNA는 ExperionTM RNA StdSens Chips를 이용하여 정량하였다.

(3-3). RNA의 de novo 시퀀싱을 위한 라이브러리 제작

최적의 라이브러리 제작을 위해 gDNA를 g-튜브에 첨가하여 AMPure PB magnetic beads (Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA)로 40 kb의 크기로 제작하였다. gDNA 및 RNA의 최종 농도는 NanoDrop spectrophotometer와 Qubit fluorometer로 측정하였으며, 약 200 ng/㎕를 field-inversion gel에 로딩하였다.

총 10㎕의 라이브러리를 PacBio DNA Template Prep Kit 1.0 (for 310 kb)를 이용하여 제작하였다.

이후 시퀀싱 수행은 3세대 시퀀싱 SMRT 기술을 이용하여 수행하였는데, 상기 3세대 시퀀싱은 PCR 증폭 과정을 생략하고, DNA 단일 분자를 바로 시퀀싱하여 서열을 확인하는 과정이다.

실험구의 DNA 단일분자는 SMRTbell 텔플레이트와 PacBio DNA/Polymerase Binding Kit P6를 이용하여 어닐링하였다. 최종적으로 생성된 SMRT 셀(cell)은 PacBio RS II (Pacific Biosciences) 시퀀싱 플랫폼에 의해 분석되었다.

(3-4). DEGs 분석

유용 산물을 생산하는데 직접적으로 관여하는 유전자들을 파악하기 위해, 테르펜이 생성되는 조건과 생성되지 않는 조건에서의 균사를 각각 분리하여 유전자 발현 차이를 확인하였다.

각 샘플들간의 DEGs(differnetailly expressed genes) 분석을 수행하기 위해서는 레퍼런스 시퀀스(reference sequence)가 필요하기 때문에, 먼저 겨울우산버섯의 총 RNA에 대한 trancriptome de novo assembly를 실시하였고, 시퀀싱 방법으로는 DNA와 마찬가지로 PacBio SMRT 시퀀싱 분석을 수행하였다.

Pacbio 시퀀싱을 통하여 확보된 겨울우산버섯의 RNA 아이소시퀀싱(isosequencing) 결과를 기반으로 하여, 6개 샘플 들간의 DEGs 분석을 위해 Illumina hiseq을 이용하여 유전자 발현값을 확인하였다.

각 샘플 fastq 들을 CLCBIO 사의 assembly cell 패키지 프로그램에 포함되어 있는 프로그램을 사용하여 레퍼런스 맵핑(referece mapping)을 실시하고, 각각 맵핑 리드 카운트(mapping read count)를 계산하였다.

각 샘플에 따른 리드 카운트들에 대해 rpkm을 실시하여 정규화(normalization)를 하였는데, 상기 RPKM을 구하는 방법은 하기의 수학식 1과 같다.

2. 결과

(1). 배양 조건에 따른 산물 분석

미생물의 이차 대사 경로는 주위 환경에 의한 영향을 받을 수 있다. 본 실시예에서는 겨울우산버섯으로부터 생성되는 세스퀴테르펜 성분들이 배양 조건에 의해 생성 영향을 받는다는 점을 확인하였다.

마그네슘 처리 조건(MgSO4-containing medium)과 무처리 조건(magnesium-free medium)에서 균사를 배양한 후, 각 일수별(5, 7, 12일)로 배양액을 분리하여 분석한 결과, 각 실험구에서 뚜렷한 생성 차이를 나타내었다.

먼저 마그네슘 무처리 조건 배양액 산물은 도 1에 제시하였다. 분석 결과 체류 시간 26.90분과 35.51분에 피크가 검출되었지만, 검출된 피크의 매스 패턴(mass pattern)을 살펴 보면, 프로판산(propanoic acid)과 1,1-디펜틸-2,13-에틸렌이 검출되었다(도 2 참조).

이로부터 비 테르펜계 화합물로 마그네슘을 포함하지 않는 배양 조건에서는 세스퀴테르펜 성분들이 검출되지 않음을 확인할 수 있었고, 상기 세스퀴테르펜 성분들은 배양 일수가 12일이 지나도 검출되지 않았다.

반면에, 마그네슘 포함 배지에서는 체류 시간 35.70분과 39.90분에 세스퀴테르펜 성분인 유데스만(eudesmane)과 유데스몰(eudesmol)의 피크가 확인되었고(도 3 및 도 4 참조), 이는 배양 일수 5, 7, 12일 동안 지속적으로 생성됨을 확인할 수 있었다.

결과적으로 배양액내 마그네슘 원소의 포함 유무에 따라 대사산물 생성이 달라짐을 확인할 수 있었다. 이는 세스퀴테르펜 생성에 관여하는 중요 단백질의 도메인 사이트(domain site)가 마그네슘 존재하에서 활성화된다는 이전의 연구 결과에 따라, 마그네슘이 세스퀴테르펜 생성에 중요 인자로 작용한다는 사실을 확인할 수 있었다.

이후 유전자 분석을 통해 생성에 관련한 유전자들이 마그네슘의 첨가 유무에 따라 발현량이 달라지는지에 대해 확인하였다.

(2). DNA 시퀀싱

겨울우산버섯 균사체의 DNA의 전장 유전체 분석(whole genome sequencing)을 수행한 결과, 게놈의 크기가 약 56 Mb로 확인되었다. N50은 11,627이었고 리드(read) 개수는 676,520개로 확인되었다.

총 콘틱(contig)의 숫자는 138개가 확인되었다. 콘틱 정보를 블라스트에 어노테이션(annotation)하여 유전자의 기능을 예측하였다. 본 실시예에서는 테르펜 물질 합성 경로에 초점이 맞춰져 있기 때문에, 관련 유전자에 대해 확인하였다.

테르펜 성분은 본래 도 5와 같은 메발론산(mevalonic acid; MEA) 경로를 거쳐 생합성 되는 것으로 알려져 있다. MEA 경로는 일차 대사 경로로 알려진 해당 과정(glycolysis)에서 유래하는데, 글루코스의 해당과정 중 생성되는 아세틸조효소 A(acetyl CoA)로부터 유래되는 경로라고 알려져 있다.

도 5의 메발론산 경로에서 Enzyme 1 내지 Enzyme 9는 하기의 표 2와 같다.

acetyl CoA로부터 세스퀴테르펜 성분의 기본 골격 구조인 파르네실피로인산(farnesyl pyrophosphate)이 생성되기 까지 아세틸조효소 A-아세틸전이효소(acetyl-CoA-acetyl transferase), 히드록시메틸글루타릴-조효소 A 합성효소(hydroxymethylglutaryl-CoA synthase), 히드록시메틸글루타릴-조효소 A 환원효소(hydroxymethylglutaryl-CoA reductase), 메발론산염 키나아제(mevalonate kinase), 메발론산인산염 탈탄산효소(phosphomevalonate decarboxylase), 메발론산2인산염 탈탄산효소(diphosphatemevalonate decarboxylase), 이소펜테닐2인산 이성화효소(isopentenyl-diphosphate isomerase), 파르네실2인산 합성효소(farnesyl diphosphate synthase)가 관여하는 것으로 알려져 있다.

이러한 효소들은 블라스트 어노테이션을 거쳐 겨울우산버섯 내에 유사한 유전자 서열이 확인되었고, 특히 버섯균으로 알려진 Dichomitus squalene과 효모의 일종인 Saccharomyces cerevisiae와 서열이 유사한 것으로 확인되었다.

또한, 겨울우산버섯으로 생성되는 주요 테르펜 화합물인 유데스몰 구조 같은 경우, 세스퀴테르펜 구조로 전구체인 파르네실피로2인산(farnesyl pyro diphosphate)으로부터 고리화(cyclization) 반응을 거쳐 생성되는 환 구조의 화합물이다.

이때 전구체로부터 인산기를 떼고 구조의 고리화를 유도하는 테르페노이드 합성효소(terpenoids synthase)의 작용이 필요하며, 본 실시예에서는 Gleophyllum trabeum의 테르페노이드 합성효소와 유사한 테르페노이드 합성효소가 존재한다는 점을 예측할 수 있었다. 즉 유데스몰의 생성을 위해 9개의 유전자가 중요한 역할을 하며, 시퀀싱 결과 겨울우산버섯 내에 9개의 유전자가 모두 존재하는 것으로 예측되었다.

(3). RNA 결과 (DEGs 분석)

DNA 서열상에서 존재하는 예상 유전자(Enzyme 1~9)들이 유데스몰 생산에 직접적으로 관여하는지 판단하기 위하여, 배양 5일째, 7일째 및 12일째에 RNA 수준에서의 유전자 발현량을 조사하였는 바, 그 결과를 도 6a 내지 도 6c에 나타내었다. 여기에서 발현량이 높다는 의미는 유전자 연관성이 높다는 사실을 말해준다.

특히 균주의 배양 조건을 유데스몰이 생성되는 조건(magnesium containing medium)과 생성되지 않는 조건(magnesium free medium)으로 설정한 후, 두 균사체에서 발현되는 유전자의 비교를 통하여 연관성을 확인하였다.

결과적으로 유전자(Enzyme 1~9)가 마그네슘을 포함하는 배양 조건에서 상대적으로 발현량이 높아지는 것을 확인할 수 있었다. 이는 유데스몰이 생성되는 조건(magnesium-containing medium)에서 테르펜 생성 관련 효소들의 발현량이 높아지며, 결과적으로 본 실시예의 결과는 테르펜 생산과 유전자(Enzyme 1~9) 발현과의 연관성이 있다는 뜻을 의미한다.

따라서, 배양액 내 마그네슘을 포함할 때 테르펜 관련 유전자의 연관성이 더 높다는 사실을 보여주고 있다. 특히 마그네슘 환경 하에서 유전자의 발현이 높았던 이유는 관련 효소가 활성화되는데 필요한 활성 부위에 바인딩되어 효소 활성화에 보조 인자 역할을 하였기 때문이라고 판단된다.

도 6a 내지 도 6c는 배양 일수별로 마그네슘 포함 유무 배지에 따른 발현량 값(fold change) 값이 높은 순서대로 나열한 것이다.

도 6a 내지 도 6c를 참조하여 차이가 크게 나는 유전자 목록을 살펴보면 세스퀴테르펜 합성효소(sesquiterpene synthase)와 이소펜테닐2인산 이성화효소(isopentenyl-diphosphate isomerase), 파르네실2인산 합성효소(farnesyl diphosphate synthase) 등이 유데스몰 생성에 직접적으로 연관되는 유전자라고 판단된다.

본 실시예를 통하여, 세스퀴테르펜 생성을 위한 중요 배양 원소를 확인하였고, 배양 원소에 따른 유전자 발현량 변화를 확인하였다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만, 통상의 기술자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

본 발명에 의한 세스퀴테르펜의 생산방법은 마그네슘을 포함하는 배지에서 배양함으로써, 겨울우산버섯의 균사 배양액으로부터 세스퀴테르펜을 효율적으로 대량 생산할 수 있는 장점을 지니기 때문에, 본 발명이 속하는 기술분야에 유용하게 적용될 수 있다.

Claims

마그네슘을 포함하는 배지에서 겨울우산버섯을 배양하여, 이소펜테닐2인산 이성화효소(isopentenyl diphosphate isomerase)를 코딩하는 유전자, 파르네실 2인산 합성효소(farnesyl diphosphate synthase)를 코딩하는 유전자 및 세스퀴테르펜 합성효소(sesquiterpene synthase)를 코딩하는 유전자의 발현량을 증대시키는 단계를 포함하는 세스퀴테르펜의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 이소펜테닐2인산 이성화효소는 하기 메발론산 경로의 Enzyme 7인 것을 특징으로 하는 세스퀴테르펜의 생산방법.
[메발론산 경로]
제1항에 있어서, 상기 파르네실 2인산 합성효소는 하기 메발론산 경로의 Enzyme 8인 것을 특징으로 하는 세스퀴테르펜의 생산방법.
[메발론산 경로]
제1항에 있어서, 상기 세스퀴테르펜 합성효소는 하기 메발론산 경로의 Enzyme 9인 것을 특징으로 하는 세스퀴테르펜의 생산방법.
[메발론산 경로]
제1항에 있어서, 상기 배지는 증류수 1L 당, 글루코스 10g, 암모늄 타르트레이트 0.2g, 마그네슘 설페이트 0.5g, 칼슘 클로라이드 0.1g을 포함하는 것을 특징으로 하는 세스퀴테르펜의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 겨울우산버섯을 배양하는 단계는 포테이토 덱스트로스 아가(PDA) 배지에서 전배양한 겨울우산버섯의 균사를 상기 배지에 접종한 후, 진탕배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 세스퀴테르펜의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 배양은 25~30℃의 온도 및 50~150 rpm의 조건으로 5~15일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 세스퀴테르펜의 생산방법.
제7항에 있어서, 상기 배양은 28℃의 온도 및 100 rpm의 조건으로 12일 동안 수행하는 것을 특징으로 하는 세스퀴테르펜의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 겨울우산버섯을 배양하는 단계의 종료 후에, 상기 겨울우산버섯의 균사 배양액에 유기 용매를 첨가하여 진탕 추출한 다음, 농축하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 세스퀴테르펜의 생산방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 방법에 의해 생산된 세스퀴테르펜.