KR20110101790A

KR20110101790A - 살아 있는 누에번데기를 이용한 밀리타리스동충하초 자실체의 배양방법

Info

Publication number: KR20110101790A
Application number: KR1020100021038A
Authority: KR
Inventors: 홍인표; 이만영; 강필돈; 성규병; 김미자; 남성희; 최용수; 김혜경; 김남숙; 이광길
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2010-03-09
Filing date: 2010-03-09
Publication date: 2011-09-16
Also published as: KR101165041B1

Abstract

본 발명은 살아 있는 누에번데기를 이용하여 밀리타리스동충하초의 자실체를 생산하는 방법으로, 밀리타리스동충하초를 보다 효율적으로 증식하기 위한 접종원 제조방법, 접종방법, 접종시기 및 배양 방법 등에 관한 것이다. 본 발명에 따르면, 살아있는 누에번데기에서 밀리타리스동충하초의 감염률 및 자실체의 발생률을 높일 수 있으며, 접종원 접종량, 접종방법, 접종시기, 배양방법 등을 표준화하여 보다 효율적이고 편리하게 재배할 수 있는 가장 경제적인 밀리타리스동충하초 자실체의 배양방법이 제공될 수 있다.

Description

살아 있는 누에번데기를 이용한 밀리타리스동충하초 자실체의 배양방법{CULTURE METHOD FOR FRUITING BODY OF CORDYCEPS MILITARIS USING LIVING SILKWOWM PUPAE}

본 발명은 살아 있는 누에번데기를 이용하여 밀리타리스동충하초의 자실체를 생산하는 방법으로, 밀리타리스동충하초를 보다 효율적으로 증식시키기 위한 접종원 제조방법, 접종방법, 접종시기 및 배양방법 등에 관한 것이다.

동충하초는 겨울에는 벌레, 여름에는 풀의 모양을 하고 있는 것에서 그 명칭이 유래된 곤충기생균(곰팡이)으로서, 계통분류학 상으로는 자낭균강, 맥각균목, 동충하초과에 속하며, 숙주가 되는 곤충으로는 나비목, 매미목, 벌목, 딱정벌레목, 메뚜기목, 거미목 등이 알려져 있다.

동충하초는 산삼, 녹용과 함께 3대 한약재로 전 세계적으로 약 300여종이 분포하며, 우리나라에서는 약 80여종이 자생한다. 이 중 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)는 항균활성을 나타내는 코디셉틴(Cordycepin) 등 생체 기능 조절물질을 함유하고 있는 것으로 보고되었으며, 또한 항비만, 항알러지, 간기능 개선효과 등의 효능이 입증되면서 기능성 식품, 건강보조 식품, 신약 등의 소재로 각광을 받고 있다.

그러나, 밀리타리스동충하초의 야생 자실체 수량은 한정되어 있으며, 살아 있는 곤충에서의 경제성 있는 인공 재배 방법이 개발되지 않아 식물성 재료인 현미를 이용하여 제한적으로 생산되고 있다. 살아있는 곤충 기주에서 생산된 밀리타리스동충하초는 자연에서의 동충하초 발생원리와 매우 유사하게 생체대사과정을 거쳐 발생되므로 보다 풍부한 기능성물질이 함유된 것으로 보고되었다. 즉 버섯에 해당하는 자실체에는 항비만, 항알러지, 간기능 개선효과 등이 우수한 물질이 풍부하며, 기주인 번데기에는 면역증강물질이 다량 함유되어 있다.

살아있는 곤충으로는 누에가 이용되고 있으며, 이 경우 일반적으로 분무접종법으로 동충하초를 접종한다. 이 방법은 현미배지에서 형성된 무성포자를 1×10⁷ 농도로 조절하여 5령 누에 기잠에 분무방식을 통해 접종하여 감염시키는 방법이다. 그러나, 이러한 분무접종 감염방법은 무성포자를 형성하는 눈꽃동충하초(Paecilomyces tenuipes) 등과 같은 불완전세대 동충하초의 경우에 유용성이 있으며, 유성포자를 형성하는 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)와 같은 완전세대 자낭균류의 경우에는 감염률이 12% 정도로 낮아 양잠 농가에서 실용화하기에는 현실적으로 많은 문제점이 있다.

따라서 누에 등을 이용하여 살아 있는 곤충에서 밀리타리스동충하초를 효율적이고 편리하게 접종할 수 있는 방법과 인공적으로 배양할 수 있는 재배방법의 개발이 절실히 요구되고 있다.

이와 같은 기술적 배경 하에서, 본 발명자들은 살아있는 누에번데기에서 밀리타리스동충하초를 인공적으로 배양하는 방법을 개발하기에 이르렀다.

결국, 본 발명의 목적은 살아있는 누에번데기에서 인공재배가 불가능했던 밀리타리스동충하초의 자실체 배양에 필요한 접종원 제조방법, 접종방법, 접종시기 및 자실체의 배양방법 등을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명에서는

밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)의 균사체(mycelium)를 준비하는 단계; 상기 준비된 균사체에 빛을 조사하여 생장이 우수한 균사를 접종원으로 선발하는 단계; 상기 선발된 접종원을 배양하여 균질화하는 단계; 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계; 및 상기 균사가 접종된 누에번데기를 배양하는 단계를 포함하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법이 제공될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)의 균사체를 준비하는 단계는 밀리타리스동충하초균을 배지에서 22~26℃로 6~8일간 배양하여 수행될 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 준비된 균사체에 빛을 조사하여 생장이 우수한 균사를 접종원으로 선발하는 단계는 50~100룩스의 빛을 24~48시간 동안 조사하여 노랗게 변색된 밀리타리스동충하초 균사체를 접종원으로 선발하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 선발된 접종원을 배양하여 균질화하는 단계는 상기 선발된 접종원을 액체 배지에 접종하여 20~25℃에서 8~12일간 배양하여 균질화하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 선발된 접종원을 배양하여 균질화하는 단계는 상기 선발된 접종원을 배양하여 호모게나이저를 이용하여 100,000~120,000rpm에서 3~10분간 잘게 파쇄함으로써 균질화하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 누에번데기에 주입하여 접종하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 누에번데기에 주사기로 주입하여 접종하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상족 후 9~11일이 경과한 살아있는 누에번데기에 접종하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 2x10⁴~2x10⁶ cfu/ml로 희석하여 살아있는 누에번데기에 접종하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기 1개당 0.05~0.1ml 주사하는 것일 수 있다.

일 실시예에 따르면, 상기 접종된 누에번데기를 배양하는 단계는 광 500~1000룩스, 온도 16~20℃, 습도 91~98%로 유지되는 조건에서 45~60일간 배양하는 것일 수 있다.

본 발명에 따르면, 살아있는 누에번데기에서 밀리타리스동충하초의 감염률 및 자실체의 발생률을 높일 수 있으며, 접종원 제조방법, 접종량, 접종방법, 접종시기, 배양방법 등을 표준화를 통해 보다 효율적이고 편리하게 재배할 수 있는 경제적인 밀리타리스동충하초의 자실체 배양방법이 제공될 수 있다.

도 1은 밀리타리스동충하초를 고체배지에 접종하여 균사체를 배양한 그림을 나타낸다. 좌측은 빛을 조사하지 않은 균사체이며, 우측은 빛을 조사한 균사체이다.
도 2는 액체 배양을 통해 수확된 밀리타리스동충하초의 균사를 균질화하여 수집한 액체 접종원을 나타낸다. 좌측은 페트리 디쉬에 담긴 육안관찰 결과이며, 우측은 헤마사이토미터 상에 균사의 숫자 및 분포를 나타내는 사진이다.
도 3은 밀리타리스동충하초의 누에번데기 주사 접종에 사용될 수 있는 자동 주사기의 모습을 나타낸다.
도 4는 밀리타리스동충하초의 감염된 누에번데기에서 발아된 자실체를 나타낸다.
도 5는 다 자란 밀리타리스동충하초 자실체 및 자낭각을 나타낸다.
도 6은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 밀리타리스동충하초의 자실체 생산 과정을 나타내는 모식도이다.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

밀리타리스동충하초(Cordypces militaris)는 주로 나비목 곤충의 번데기를 기질로 자실체를 형성한다. 상기 자실체는 생육의 이전단계인 균사체 단계를 거치게 되는데, 이러한 균사체는 도 1과 같이 실타래 모양의 자실체 이전의 생육단계에서 나타나는 구조를 말한다. 자실체는 도 5에 나타난 바와 같이 다 자란 동충하초, 즉 버섯을 의미한다. 자실체는 통상적인 식물의 씨에 상응하는 자낭포자를 담고 있는 자낭각(도 5의 우측)을 갖고 있다.

본 발명은 살아있는 누에번데기에 밀리타리스동충하초균을 접종하여 자실체를 형성시키는 배양 방법을 제공한다. 본 발명에 따르면, 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)의 균사체(mycelium)를 준비하는 단계; 상기 준비된 균사체에 빛을 조사하여 생장이 우수한 균사를 접종원으로 선발하는 단계; 상기 선발된 접종원을 배양하여 균질화하는 단계; 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계; 및 상기 균사가 접종된 누에번데기를 배양하는 단계를 포함하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법이 제공될 수 있다.

상기 밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)의 균사체를 준비하는 단계는 밀리타리스동충하초균을 배지에서 22~26℃로 6~8일간 배양하는 것을 포함한다. 이 때 배지는 YpSs (Yeast Extract, potassium Phosphate & Souble Starch) 또는 PDA(Potato Dextrose Agar) 등의 고체 평판 배지를 예로 들 수 있으나, 균사체의 배양이 가능한 것이면 무엇이든 가능하다. 온도는 22℃이하로 낮거나 26℃를 넘게 되면 생육이 활발하게 진행되지 않아 바람직하지 않다. 또한, 배양일이 6일을 넘지 않은 경우에는 생육이 충분하지 않아 바람직하지 않고, 배양일이 8일을 넘게 되면 배양된 균사체의 생리활성이 떨어지는 단점이 있어 바람직하지 않다.

본 발명은 상기 준비된 균사체에 빛을 조사하여 생장이 우수한 균사를 접종원으로 선발하는 단계를 포함한다.

이를 위해서는, 상기와 같이 고체 평판 배지에서 배양된 균사가 배지의 가장자리까지 자랐을 때에 20~200룩스, 보다 상세하게는 50~100룩스의 빛을 24~48시간 동안 조사한다. 빛을 조사하면 밀리타리스동충하초의 균사체가 노랗게 변색되는데, 이렇게 변색된 균사체가 생장이 활발하며, 기주인 곤충에 대한 감염률이 더 높다. 이 때, 50룩스 이하의 빛에서는 노란색으로의 변성이 일어나지 않거나 변색이 지나치게 더디게 진행되므로 바람직하지 않고, 100룩스 초과인 경우에는 변색되는 효과에 비해 지나치게 높은 빛에너지를 소모하게 되어 경제적인 측면에서 바람직하지 않다. 상기와 같이 빛이 조사되어 노랗게 변한 균사체를 선발하여, 활발히 자라는 균사 말단의 생장부위를 코르크보러 또는 메스를 이용하여 절취하여 균사 절편을 만든다.

본 발명은 상기 선발된 접종원을 배양하여 균질화하는 단계를 포함한다.

이를 위해 상기에서 절취된 균사 절편을 PDB (Potato Dextrose Broth) 액체 배지에 접종하여 20~25℃에서 8~12일간 정치 배양한다. 이 과정을 통해서 대량의 균사체를 수집할 수 있다. 이렇게 수집된 대량의 균사체는 균질화하는 과정을 거칠 수 있다. 예를 들면 호모게나이저(homogenazer, wheaton사)를 이용하여 100,000~120,000rpm에서 3~10분간, 보다 상세하게는 5분 간 균사체를 잘게 파쇄함으로써 일정한 크기의 균사들의 집합으로 균질화시킬 수 있다. 이 경우, 해부현미경으로 관찰하면 균사체가 얼마나 균질화되었는지를 판단할 수 있다. 이러한 균질화 과정을 통해 2~20개의 격벽만이 관찰되는 많은 수의 짧은 균사체로 파쇄되도록 함으로써, 살아있는 누에번데기에 대한 밀리타리스동충하초의 감염률을 높일 수 있다. 격벽이 2 미만인 균사는 균질화 과정의 지나친 물리적 충격 또는 적합하지 않은 용액의 삼투압 등으로 인해 균사 자체의 구조가 파괴된 것을 의미하므로, 향후의 자실체 발생이 진행되지 않을 수 있어 바람직하지 않다. 개개의 균사가 20개 이상의 격벽을 갖게 되는 정도로 긴 경우에는 추후 주사기를 통한 균사의 주입시 주사바늘이 쉽게 막힐 수 있어 적합하지 않다. 바람직한 정도의 균질화 정도를 갖는 접종원을 도 2(육안관찰 결과는 좌측, 현미경 관찰 결과는 우측)에 나타내었다. 상기 100,000~120,000rpm에서 3~10분간 수행되는 호모게나이저를 이용한 파쇄는 이러한 정도의 균질화에 요구되는 조건의 예이다.

본 발명은 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계를 포함한다. 접종은 누에번데기의 체내에 균사를 주입하는 것으로써 이루어진다. 누에번데기의 체내로 균사를 주입하는 방법은 여러 가지가 있을 수 있으나, 본 발명의 일 실시예에서는 주사기로 주입하여 균사를 살아있는 누에번데기에 접종한다.

이와 같이 살아있는 누에번데기에 균사를 접종한 이후 가장 중요한 것은 밀리타리스동충하초균의 감염률이다. 감염률을 보다 높이기 위해서 누에번데기의 크기 및 영양상태, 생존력 등 다양한 인자가 고려될 수 있다.

본 발명에 따르면 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상족 후 9~11일이 경과한 살아있는 누에번데기에 주사하여 이루어질 수 있다. 누에번데기에 대한 최적 접종 시기는 상족(누에가 실을 토할 수 있도록 섶에 올리는 일) 9~11일이 경과한 시점이 가장 바람직하다. 상족 후 9일이 경과하지 않았거나, 11일이 경과한 시점에 접종하였을 경우에는 누에의 생리활성이 적합하지 않아 동충하초균의 감염률이 높지 않으며, 상족 후 9일이 경과한 누에고치를 절견하여(잘라) 즉시 접종하는 것이 감염률 측면에서 가장 바람직하다.

본 발명에 따르면, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 2x10⁴~2x10⁶cfu/ml로 희석하여 살아있는 누에번데기에 접종하는 것일 수 있다.

접종시 동충하초 균사체의 농도는 표 2에서와 같이 2x10⁵cfu/ml 이상 함유된 접종량을 누에번데기에 주사할 때 감염률이 가장 높았으며, 2x10⁴cfu/ml 이하의 농도에서는 감염률이 급격히 감소하였다. 도 2 에는 2x10⁵cfu/ml이상의 개체수로 잘 균질화된 종균의 분포양상을 헤마사이토미터(Hemacytometer) 상에 예시적으로 나타내고 있다.

본 발명에 따르면, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기 1개당 0.05~0.1ml 주사하여 이루어질 수 있다.

접종량은 표 3에서와 같이 균사농도가 2x10⁵cfu/ml 이상되는 경우, 접종량 0.025~0.1ml를 누에번데기에 주사 접종해도 감염률은 양호하였으나 0.05ml 이하에서는 자실체 발생이 매우 저조하였으며, 0.1ml 이상에서는 번데기의 체적을 초과하여 번데기가 터지는 경우가 빈번하게 발생하였다. 접종시의 접종량과 균사체의 농도는 향후 동충하초의 발생에 필요한 적절한 수분이 유지되면서도 실질적으로 감염을 유발할 수 있는 충분한 숫자의 균사가 적당한 숫자로 포함될 수 있도록 하는 의미를 가지기 때문에 매우 중요하며, 균사체 농도는 2x10⁵cfu/ml 이상, 접종량은 0.05ml로 이루어질 때 감염률이 양호한 것으로 나타났다.

접종시의 접종기구는 도 3에서와 같이 접종량을 임의로 조절할 수 있는 자동주사기를 이용하면 잡균의 오염을 줄일 수 있고 효율적이다. 이와 같은 과정을 통해 감염되어 표면에 실타래와 같은 균사체가 형성된 누에번데기를 도 4에 나타내었다.

본 발명에 따르면, 상기 접종된 누에번데기를 배양하는 단계는 상기 접종된 누에번데기를 광 500~1000룩스, 온도 16~20℃, 습도 91~98%로 유지되는 조건에서 45~60일간 배양할 수 있다.

도 4에 나타난 것과 같이 감염된 상태의 누에번데기는 표 4에서와 같이 광 500~1000룩스, 온도 16~20℃, 습도 91~98%로 유지되는 생육실에서 배양하면 자실체 발이 및 생육이 양호한 것으로 조사되었다. 이 때, 빛이 500룩스 미만에서는 표 4에서와 같이 자실체의 길이가 짧고, 직경이 가늘어 바람직하지 않으며, 1000룩스 이상일 경우에는 자실체의 개체수가 증가하고 직경이 가늘고 생육이 불규칙하여 바람직하지 않다. 또한, 온도가 20℃를 넘게 되면 자실체가 형성되지 않고 균사체가 생성되는 비율이 증가하였으며, 16℃미만에서는 생육이 부진하여 바람직하지 않다. 또한 밀리타리스동충하초의 자실체는 충체로부터 분리시켜 수확하게 되는데, 쉽게 건조되어 버리는 속성이 있어 습도가 91%미만인 경우에는 발생하지 않거나 생장속도가 매우 느려 바람직하지 않다.

상기에서 술한 밀리타리스동충하초의 전반적인 자실체 생산 과정은 도 6에 모식도로 나타나 있다.

이하에서는 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1. 밀리타리스동충하초균 접종원의 제조

밀리타리스동충하초 균주는 농촌진흥청 국립농업과학원 보존균주(C28, C116, C197, C209, C214)를 사용하였다. 이를 각각 YpSs (Yeast Extract, potassium Phosphate & Souble Starch) 평판배지의 중앙에 이식한 다음, 25℃에서 7일 동안 배양하여 균사가 배지의 가장자리까지 자랐을 때 100룩스의 빛에 노출시켰다. 광원은 백열등의 산광을 이용하였다. 그런 다음, 노란색으로 변색되는 균사체만 선발하여, 균사의 생장이 활발히 일어나고 있는 가장자리 부분을 코르크보러를 이용하여 5mm 크기의 절편을 만들었다.

이러한 균사 절편은 100ml의 PDB(Potato Dextrose Broth) 액체 배지에 각각 접종하여 25℃에서 10일 동안 정치 배양하였다. 균사층이 형성된 후 이를 수확하여 호모게나이져(wheaton사)로 120,000rpm에서 5분간 작동하여 균사층을 잘게 부수어 균질화하였다. 균질화 과정에서 매 분마다 해부현미경으로 확인하여 부수어진 각각의 균사가 2~20개 정도의 격벽을 보이는 정도로 균질화된 것을 확인한 다음, 증류수로 (2.5±0.5)x10⁵cfu/ml 농도가 되도록 희석하였다.

실시예 2. 접종 방법별 감염률 측정

먼저 5령 기잠 누에에 현미배지에서 자란 무성포자를 분무접종하였으며, 접종한 누에는 온도 23~24℃, 습도 65~75% 조건하에서 사육하였다. 그런 다음 이를 20℃에서 7~9일 동안 사육한 후 절견하여 감염률을 측정하였다. 주사접종은 상족(누에올리기) 9일이 경과한 누에고치를 수확하고 절견하여 살아있는 번데기를 준비한 다음, 실시예 1을 통해 준비된 각각의 밀리타리스동충하초 균사체 접종원을 균주별로 도 3에 도시된 바와 같은 자동주사기를 이용하여 0.05ml씩 주사접종을 통해 누에번데기에 처리하였다. 그런 다음 이를 20℃에서 5~7일동안 배양하여 감염률을 측정하였다.

하기의 표는 밀리타리스동충하초의 접종방법별 감염률을 나타낸다.

균주	감염률(%)
균주	분무접종	주사접종
C28	24.7	99
C116	7.83	98
C197	5.67	97
C209	13.5	99
C214	7.83	98
평균	11.9	98.2

상기 표 1에 나타난 바와 같이 분무접종에 의한 밀리타리스동충하초균의 평균 감염률이 11.9%에 지나지 않는데 비해, 주사접종에 의한 감염률은 평균 98.2%인 것으로 나타났다.

실시예 3. 접종원의 접종량 결정

실시예 2와 같이 5령에 달하여 상족(누에올리기) 9일이 경과한 누에고치를 절견하여 살아있는 번데기를 준비하여, 실시예 1에서 준비된 밀리타리스동충하초균 접종원을 주사기로 접종하였다. 각 개체에 대한 접종원의 균사체의 농도(균수)를 2x10⁶부터 2x10³cfu/ml까지 10단위씩 희석하여 0.05ml씩 주사하여 감염률을 측정하였다. 하기 표에 나타난 바와 같이, 2x10⁵cfu/ml이상의 경우에 감염률이 현저하게 높아지는 것으로 관찰되었다. 상기 접종은 도 3에 나타난 바와 같이 잡균의 오염을 방지하기 위해 자동주사기를 이용하여 수행하였다.

접종원 농도(cfu/ml)	공시 두수(마리)	감염두수(마리)	감염률(%)
2x10⁶	192	188	97.3
2x10⁵	84	81	96.4
2x10⁴	298	23	7.74
2x10³	173	7	4.0

상기의 표는 접종원 농도에 따른 감염률을 나타내며, 2x10⁵~2x10⁶cfu/ml 구간에서 현저하게 증가된 감염률을 나타내고 있다.

실시예 2와 같이 상족 9일이 경과한 누에번데기를 준비하여, 실시예 1에서 준비된 밀리타리스동충하초균 접종원의 농도를 2x10⁵cfu/ml로 조절하고 각 개체에 대한 주사량을 0.025ml 부터 0.1ml까지 0.025ml 단위로 주사하여 감염률을 측정하였다. 하기 표에 나타난 바와 같이, 접종량에 따른 감염률은 차이가 없었으나 0.05ml 이하에서는 자실체 발생이 매우 저조하였으며, 0.1ml 이상에서는 번데기의 체적을 초과하여 번데기가 터지는 경우가 빈번하게 발생하였다. 따라서 동충하초의 발생에 필요한 적절한 수분이 유지되면서도 실질적으로 감염을 유발할 수 있는 최적 접종량은 0.05ml로 조사되었다.

접종원 접종량(ml)	공시 두수(마리)	감염두수(마리)	감염률(%)
0.1	50	49	98.0
0.075	50	50	100.0
0.05	50	50	100.0
0.025	50	49	98.0

실시예 4. 자실체 발이 및 생육에 광량이 미치는 영향 관찰

실시예 3의 방법을 통해 감염된 누에 100개체를 수집하여, 자실체의 생육을 관찰하였다. 자실체의 생육시 온도 조건은 20℃이며, 습도는 91% 이상을 유지하도록 하였다. 광원은 백열등의 산광을 이용하였다.

하기의 표는 광량(룩스)이 자실체 발이에 미치는 영향을 나타내고 있다.

광량(룩스)	자실체 특징
광량(룩스)	자실체수	길이(mm)	직경(mm)
0	자라지 않음	-	-
100	6	34.1 ± 2.42	1.70 ± 0.38
500	3	69.5 ± 3.95	3.10 ± 0.63
1000	5	69.7 ± 7.99	2.41 ± 0.80

표 4에서와 나타난 바와 같이 광량이 500룩스 이상 1000룩스 이하의 구간에서 자실체의 생육이 매우 양호한 수준으로 나타나는 것을 알 수 있다. 무광에서는 자실체 발생이 불량하였으며, 500룩스 이하에서는 자실체의 길이가 짧고, 직경이 가늘어 불량하였으며, 1000룩스 이상일 경우에는 자실체의 개체수가 증가하고 직경이 가늘고 생육이 불규칙하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims

밀리타리스동충하초(Cordyceps militaris)의 균사체(mycelium)를 준비하는 단계;
상기 준비된 균사체에 빛을 조사하여 생장이 우수한 균사를 접종원으로 선발하는 단계;
상기 선발된 접종원을 배양하여 균질화하는 단계;
상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계; 및
상기 접종된 누에번데기를 배양하는 단계;
를 포함하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 밀리타리스동충하초의 균사체를 준비하는 단계는 밀리타리스동충하초균을 배지에서 22~26℃로 6~8일간 배양하여 수행되는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 준비된 균사체에 빛을 조사하여 생장이 우수한 균사를 접종원으로 선발하는 단계는 50~100룩스의 빛을 24~48시간 동안 조사하여 노랗게 변색된 밀리타리스동충하초 균사체를 접종원으로 선발하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 선발된 접종원을 배양하여 균질화하는 단계는 상기 선발된 접종원을 액체 배지에 접종하여 20~25℃에서 8~12일간 배양하여 균질화하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 선발된 접종원을 배양하여 균질화하는 단계는 상기 선발된 접종원을 배양하여 호모게나이저를 이용하여 100,000~120,000rpm에서 3~10분간 잘게 파쇄함으로써 균질화하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 누에번데기에 주입하여 접종하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 누에번데기에 주사기로 주입하여 접종하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상족 후 9~11일이 경과한 살아있는 누에번데기에 접종하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 2x10⁴~2x10⁶cfu/ml로 희석하여 살아있는 누에번데기에 접종하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제9항에 있어서, 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기에 접종하는 단계는 상기 균질화된 접종원을 살아있는 누에번데기 1개당 0.05~0.1ml 주사하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 접종된 누에번데기를 배양하는 단계는 광 500~1000룩스, 온도 16~20℃, 습도 91~98%로 유지되는 조건에서 45~60일간 배양하는 것을 특징으로 하는 밀리타리스동충하초 자실체의 배양 방법.