KR20090054114A

KR20090054114A - 번데기동충하초버섯의 인공재배시 고함량의 코디세핀을안정적으로 생산하는 방법

Info

Publication number: KR20090054114A
Application number: KR1020070120826A
Authority: KR
Inventors: 한길전; 최영상; 이승연; 전달수
Original assignee: 예산군농업기술센터
Priority date: 2007-11-26
Filing date: 2007-11-26
Publication date: 2009-05-29

Abstract

본 발명은 번데기동충하초의 인공배양시 고함량의 코디세핀을 안정적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 자연에서 채집되거나 인공배양된 동충하초의 자실체로부터 분리한 단포자의 자실체를 유도하여 자실체 형성능 및 코디세핀함량이 우수한 균주를 선발한 후, 선발된 균주의 포자와 다른 균주들의 포자를 조합육종하여 자실체 형성능 및 코디세핀 함량이 높은 동충하초균을 선발하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

코디세핀, 동충하초, 조합육종

Description

번데기동충하초버섯의 인공재배시 고함량의 코디세핀을 안정적으로 생산하는 방법 {Method for producing high amount of Cordycepin from the cultivated Cordyceps militaris}

본 발명은 번데기동충하초버섯(Cordyceps militaris (Linnaeus: Fries) Link.)을 인공재배할 때 높은 함량의 코디세핀을 안정적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

동충하초속균은 자낭균문(Ascomycota), 핵균강(Pyrenomycetes), 맥각균목(Clavicipitales), 맥각균과(Clavicipitaceae), 동충하초속(Cordyceps)에 속한다. 번데기동충하초(Cordyceps militaris(Linnaeus: Fries) Link.)는 주로 나비목(Lepidoptera)의 유충 또는 번데기를 기주로 하여 주황색의 곤봉형 자좌를 형성하는 곤충기생균(Entomopathogenic fungi)의 일종이며, 자낭각은 반나생형이며 원통형의 자낭 내에는 사상의 자낭포자들이 존재한다.

동충하초의 자실체의 생산기술로는 자연상태에서 자실체를 채집하는 방법 외 에, 누에 번데기를 이용한 종균배양 및 재배방법, 그리고 다양한 인공배지를 이용한 대량 배양 방법 등이 개발되었다. 예를 들면, 곤충을 이용한 동충하초버섯의 대량 재배방법(한국등록특허 제10-179455호)과 동충하초의 원균을 평판배양시키고 액체 접종하여 곡물배지에서 자실체를 생산하는 방법(한국등록특허 제10-266082호), 번데기, 누에, 굼벵이 등과 같은 동물성 배지에 진피(陳皮)를 혼합시킴을 특징으로 하거나(한국등록특허 제10-0432472호), 글루텐, 대두단백 및 맥주 효모 등을 첨가하여 재배하는 방법(한국등록특허 제10-0644243호) 등이 있다.

기존의 동충하초 생산방법은 자연에서 채집된 동충하초를 조직이나 포자를 분리하여 자실체형성을 유도한 후 자실체 형성이 양호한 균주를 선발하는 방법이 대부분인데, 이러한 방법으로 동충하초균을 관리하면 계대배양에 따른 세력약화로 자실체를 형성하지 않는 단점이 있다.

번데기동충하초에는 면역기능을 강화시키는 성분이 함유되어 있어 세포면역과 체액면역을 촉진시키고 면역기능을 현저히 보강시켜 각종 종양과 바이러스 감염에 대한 저항력을 높이는 등의 효과가 있는 것으로 밝혀진 바 있다. 한국특허공개번호 제10-2001-0093364호에는 동충하초 배양 균사체의 추출물이 져캣(Jurkat), U937, HL-60 등의 종양세포에서 세포자살적 DNA 단편화를 유발하여 이를 사멸시키는 항암활성을 갖는다는 것이 기재되어 있다. 또한 동충하초는 항당뇨효과가 있다고 알려져 있다(오영범, 2003, 한림대학교 석사논문 “약물에 의해 유도된 당뇨, 간독성과 지질대사에 미치는 동충하초의 효능에 관한 연구”)

커닝햄 등에 의하여 번데기동충하초(C. militaris) 버섯에 다량 함유되어 있 는 퀸익산(quinic acid)의 이성체인 코디세핀(Cordycepin, 3-deoxyadenosine)과 같은 유용한 약리성분이 밝혀지면서 (Cunningham, KG 등, J. Chem. Soc., p2299-3000, 1951), 번데기동충하초에 관한 관심이 날로 증가되고 있다.

<코디세핀>

코디세핀은 한국공개특허 제10-2005-0063164호를 통하여 당뇨병의 치료 및 예방용 의약품 및 건강기능식품으로 이용할 수 있다는 것이 공개된 바 있으며, 한국등록특허 제10-0516026호에는 붉은자루동충하초(C. pruinosa)로부터 생산되는 코디세핀을 유효성분으로하는 혈관재협착예방 및 치료용 조성물에 대하여 기재되어 있다.

코디세핀의 생산과 관련된 특허출원으로는 아데노신을 생변환 기질로 하여 번데기동충하초 균사체를 배양하여 항바이러스성 코디세핀을 생산하는 방법을 기재한 한국특허출원 제10-2006-0064175호가 있으나, 상기 출원에서 번데기동충하초균의 액체 배양시 균사체의 회수율(건조)이 0.2-1% 정도이고 액체배양된 균사체를 파쇄하여 코디세핀을 정제하여야 함을 고려하면 상기 출원에 기재된 방법에 의한 코 디세핀의 생산 단가가 상당히 높을 것으로 추정된다. 따라서 보다 효율적이고 경제적으로 고함량의 코디세핀을 생산하는 방법의 개발이 필요하다.

이곳에 기재된 정보들은 단지 본 발명의 기술적 배경에 대한 이해를 돕고자 하는 것으로서, 본 발명에 대한 선행기술로써 작용할 수 없음은 당연한 일이다.

번데기동충하초를 인공배양시, 고함량의 코디세핀을 경제적이면서 안정적으로 생산하는 방법을 찾아내는 것이 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제이다.

본 발명의 발명자들은 상기 기술적 과제의 해결방법으로서 자연에서 채집되거나 인공배양된 동충하초의 자실체로부터 분리한 단포자의 자실체를 유도하여 자실체 형성능, 코디세핀함량 및 조합능력이 우수한 균주를 선발한 후, 선발된 균주의 포자와 다른 균주들의 포자를 조합육종하여 자실체 형성능 및 코디세핀 함량이 높은 동충하초균을 선발하는 것을 포함하는 고함량의 코디세핀을 안정적으로 생산하는 방법을 제공한다.

본 발명은 번데기동충하초버섯에서 추출되는 코디세핀의 함량을 높이는 방법으로서, 자연에서 채집하거나 인공재배한 자실체에서 활용이 가능하며, 본 발명에 의한 번데기동충하초의 자실체는 균주의 계통적 특성이 유지됨으로써 균주의 변이가 예방되어 고함량의 코디세핀을 갖는 번데기동충하초버섯을 안정적으로 생산하는 효과가 있다.

본 발명은 번데기동충하초의 인공배양시 고함량의 코디세핀을 안정적으로 생산하는 방법에 관한 것으로, 자연에서 채집되거나 인공배양된 동충하초의 자실체로부터 분리한 단포자의 자실체를 유도하여 자실체 형성능, 코디세핀함량 및 조합능력이 우수한 균주를 선발한 후, 선발된 균주의 포자와 다른 균주들의 포자의 조합육종을 실시하여 자실체 형성능 및 코디세핀 함량이 높은 동충하초균을 선발하는 것을 포함하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 발명자는 자연에서 채집된 번데기동충하초로부터 단포자들을 분리한 후, 그 중 5개의 단포자를 번데기를 배지로 하여 인공자실체를 형성하도록 배양하여 각각의 자실체형성능을 관찰하고 코디세핀함량을 측정하였다. 그 중에서 자실체 형성이 빠르고 균일하게 되고(도1), 코디세핀함량(표2)이 가장 높으며, 조합능력도 뛰어난 균주(C06S05)를 선발하였다.

선발된 균주(C06S05)의 포자와 신규의 다른 균주들의 포자를 함께 배양하여 자실체를 형성시켜 자실체 형성이 빠르고 코디세핀함량이 높은 균주의 조합(C06S05xC06S33, C06S05xC06S43)을 선발하였다.

이렇게 선발된 균주는 자실체 형성능이 뛰어나고 고함량의 코디세핀을 가지고 있어 이를 배양하면 다량의 코디세핀을 얻을 수 있다. 또한 이러한 방법을 사용할 경우 선발된조합들은 F1으로써, 예를 들어 C06S05(♀)xC06S33,C06S43(♂)의성격을 나타내게 되어 안정적이며 잡종강세에 의해서 세력약화가 예방되며, 따라서 안정적으로 고함량의 코디세핀을 생산할 수 있다.

또한 선발된 균주(C06S05xC06S33)의 적절한 균사배양온도를 찾기 위하여 다양한 온도에서 배양한 결과 20~25^oC에서 균사생장이 양호한 것으로 나타났다.

상기와 같은 실험결과를 기초로 본 발명에서는 다음과 같은 고함량의 코디세핀을 안정적으로 생산하는 방법을 제공한다.

[1] (a) 동충하초의 자실체로부터 단포자를 분리하는 단계;

(b) 분리한 단포자들을 각각 배양하여 자실체를 유도하고, 자실체 형성능, 코디세핀함량 및 조합능력이 우수한 균주를 선발하는 단계;

(c) (b) 단계에서 선발된 균주의 포자를 다른 균주들의 포자와 조합배양하여 자실체 형성능 및 코디세핀 함량이 높은 동충하초균을 선발하는 단계를 포함하는 동충하초로부터 고함량의 코디세핀을 안정적으로 생산하는 방법.

[2] [1]에 있어서, 동충하초가 번데기 동충하초인 방법.

[3][1]에 있어서, 동충하초의 배양온도를 20~25^oC로 유지하는 방법.

[4] [1] 내지 [3] 중 어느 하나의 방법에 의하여 생산되며, 국립종자관리소에 품종보호출원(출원번호 출원2007-125)된 번데기동충하초.

실시예

이하,실시 예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되어서는 아니 된다는 것은 당연하다.

< 실시예1 > 단포자의 분리

충남 예산군 덕산면 옥계리에서 채집된 번데기동충하초버섯의 신선한 자실체로부터 PDA(potato dextrose agar)배지가 분주된 pertidish에서 단포자를 분리하였으며 분리된 단포자는 YMA(yeast malt agar)배지에 계대하여 시험하였다. 상기와 같은 방법으로 44개의 단포자를 분리하고 C06S01 ~ C06S44의 번호를 붙였다. 분리된 단포자는 YMA(yeast malt agar)배지에 계대하여 시험에 사용하였다.

< 실시예 2> 단포자의 선발

1100cc 배양병에 번데기 80g을 첨가한 후 멸균하고, 분리된 단포자 중 5 균주를 20㎖씩 접종하여 20±2℃의 배양실에서 60일간 배양하여 인공자실체를 형성하도록 하였다.

C06S01균주는 자실체 형성기간이 빠른 편이나 자실체가 균일하지 못하였고 C06S02균주는 자실체의 형성이 느렸지만 자실체가 균일한 특징을 가지고 있었다. 또한 자실체의 속은 차 있는 형태이다. C06S03균주는 C06S02균주보다도 자실체 형성이 늦고 불균일하면서 자실체의 머리부분 끝에 흰색의 균사가 생기는 특징이 있고 불균일하였다. C06S04균주는 자실체를 형성하지 못하였다. C06S05균주는 균일하고 발이수도 많으며 자실체의 속이 차있는 형태를 나타내었다(도1 및 표1).

상기 단포자 배양으로 형성된 인공자실체의 단백질, 당함량 및 코디세핀 함량을 조사하였다.

단백질 및 당함량은 AOAC 방법(1995, Official Method of Analysis(16th Edition) Association of Official Analytical Chemist, Washington, D.C.)에 따라 분석하였다. 즉 조단백질은 켈달법으로, 당류는 Anthron법으로 분석하였다. 건조시료 1 g 을 질산, 과염소산과 질산의 혼합액 및 염산을 순차적으로 이용하여 분해시킨 후 일정량으로 희석, 여과한 후 ICP analyzer (GBC integra XMP, Australia)를 사용하여 원자흡광광도법으로 정량하였다.

코디세핀은 열수와 80% ethanol을 이용하여 추출한 다음 HPLC를 이용하여 분석하였다. 시료 5g을 정확히 측정한 후 여기에 물 100g을 가한 다음 90℃의 온도에서 6시간 추출하여 여과한 다음 위의 방법으로 재반복하여 추출한 다음 추출여액을 20mL로 농축하였다. 이 농축액에 4배량의 에탄올을 가하여 하루밤 방치한 후 원심분리시킨 다음 농축하여 50mL로 정용하였다. 이 정용액을 0.45㎛의 membrane filter로 여과한 다음 HPLC로 분석하였다. 사용한 HPLC의 분석기기는 Waters 510(USA) 기기를 이용하였으며 그 분석조건으로 컬럼은 Novapak C₁₈ (3.9×300 mm), 이동상용매는 CH₃CN : H₂O (18:82, v/v), Flow rate는 0.75 mL/min, 검출기는 UV로 254 nm에서 측정하여 표준품인 cordycepin(Sigma사, USA)으로 비교 산출하여 정량하였다.

배양특성, 생물학적 효율(%) 등의 상기 배양실험결과 및 코디세핀 함량을 고려하여 C06S05균주를 다음단계에서 실시할 조합육종의 검정친 후보로 선발하였다.

< 실시예 3> 단포자 조합능력시험

분리된 단포자를 이용하여 조합능력을 조사하기 위하여 1100cc배양병에 번데기 80g을 첨가한 후, 멸균하여 액체배양된 조합균주를 20㎖씩 접종하여 20±2℃의 배양실에서 60일간 배양한 후 자실체 형성을 유도하여 조사하였다.

C06S01xC06S02균주는 숙기가 빠르고 자실체의 길이도 긴 편이다. 자실체의 발이수가 중간 정도이며 자실체의 발생이 균일하지 못하고 2차 자실체의 생장이 있다. C06S01xC06S03균주는 숙기가 빠르며 자실체의 길이가 긴 편이다. 자실체의 굵기가 가늘어서 수확기에 자실체가 옆으로 쓰러지며 자실체의 발생이 균일하지 못하다. C06S01xC06S04균주는 기주인 번데기에 균사의 성장이 느리며 자실체의 형성이 약하며 발생한 자좌의 충실도가 좋지 못하였다. C06S01xC06S05균주는 숙기가 빠르고 자실체의 굵기도 굵은 편이다. 2차 자실체의 성장이 있으나 조생종균주로써 이용가능하다. C06S02xC06S03균주는 자실체의 발생이 느리고 2차 가지치기 심하다. 자실체는 속이 차있는 형태이다. C06S02xC06S04균주는 균사의 성장이 느리고 자실체의 발생도 저조하였다. C06S02xC06S05균주는 숙기와 길이가 중간 정도이며 자실체의 속은 차있는 형태이었으며 균일도가 양호하였다. C06S03xC06S04균주는 자실체의 발생이 없었다.

번데기80g을 배지로 1100cc 배양병에서 인공자실체를 형성한 후　 실시예2에 기재된 방법에 의하여 각 조합의 단백질과 당함량, 코디세핀 함량을 조사하였다.

실시예2 및 실시예3을 통하여 자실체 형성능, 코디세핀함량, 조합능력을 고려하여 C06S05를 다음에 실시할　조합육종을 위한 검정친으로 선발하였다. C06S05는 버섯발생도 빠르고 균일하였다.

< 실시예 4> 자실체 형성 우수 균주선발

선발된 C06S05균주에 C06S06균주부터 C06S44균주까지의 단포자를 번데기를 이용하여 YMB(yeast malt broth)배지에 4일간 배양하였다.

C06S05 균주와 다른 균주들을 조합육성시 자실체 형성 상황

균주조합	자낭각형성 유무	자좌		발이수	자실체(g/병)		생물학적효율(%)
균주조합	자낭각형성 유무	길이 (cm)	굵기 (mm)	발이수	생체 중량	건조중량	생물학적효율(%)
C06S05 X C06S06	X	2	2.0	7.0	12.5	2.3	49.1
C06S05 X C06S07	X	2	5.0	9.8	23.5	4.4	125.6
C06S05 X C06S08	X	0.5	1.0	1.8	3.8	1.0	15.1
C06S05 X C06S09				0.0	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S010	X	1	5.0	7.5	12.5	2.8	43.7
C06S05 X C06S011		0	0	0.0	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S012	X	4	5.5	15.3	30.0	6.6	120.0
C06S05 X C06S013	O	6.5	4.0	61.3	50.0	9.1	267.5
C06S05 X C06S014	O	3	1.2	160.0	28.8	4.9	132.3
C06S05 X C06S015	X	2.5	4.0	53.8	35.0	6.5	177.1
C06S05 X C06S016	X	3.5	2.0	10.3	12.0	2.1	48.1
C06S05 X C06S017	O	4	1.2	100.0	27.5	4.2	117.8
C06S05 X C06S018		0	0.0	150.0	2.3	0.4	9.7
C06S05 X C06S019		0		0.0	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S020	X	2	2.0	35.0	17.3	2.6	78.2
C06S05 X C06S021	O	3	2.0	36.5	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S022	X	3	2.0	175.0	39.0	6.7	194.2
C06S05 X C06S023		0		0.0	8.3	1.6	35.1
C06S05 X C06S024		0		0.0	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S025	X	1	2.0	15.0	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S026	O	3	1.2	105.0	5.0	1.1	20.9
C06S05 X C06S027		0		0.0	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S028	X	2	1.0	45.0	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S029		0		0.0	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S030	O	4	2.5	125.0	33.0	5.6	172.8
C06S05 X C06S031	X	6	3.0	31.3	35.3	5.7	284.3
C06S05 X C06S032	O	9	4.5	100.0	50.0	5.4	831.5
C06S05 X C06S033	O	9	5.0	100.0	66.6	9.2	759.1
C06S05 X C06S034		0		0.0	0.0	0.0	0.0
C06S05 X C06S035	X	7	7.0	5.5	22.5	5.8	144.4
C06S05 X C06S036	X	11	9.0	5.0	40.6	7.3	313.8
C06S05 X C06S037	O	6	5.0	60.0	23.0	3.5	147.2
C06S05 X C06S038	O	7	3.0	90.0	35.0	6.2	334.9
C06S05 X C06S039	O	7	3.0	100.0	41.6	6.4	329.6
C06S05 X C06S040	O	3.5	2.0	60.0	23.0	2.6	153.0
C06S05 X C06S041	O	5	2.3	68.0	25.5	3.0	174.7
C05S06 X C06S042	X	2	2.0	10.0	4.6	0.8	25.5
C06S05 X C06S043	X	6	5.0	18.0	41.6	7.5	334.2
C06S05 X C06S044	X	4.5	4.0	15.0	38.3	6.8	283.2

이 결과로부터 C06S05xC06S13, C06S05xC06S22, C06S05xC06S31, C06S05xC06S32, C06S05xC06S33, C06S05xC06S36, C06S05xC06S43을 선발하여 코디세핀 함량을 측정하였다.

코디세핀 함량을 고려하여 C06S05×C06S33균주와 C06S05×C06S43균주를 선발하였다.　 단포자인 C06S05균주의 Cordycepin함량은 246㎎%이었고 C06S05×C06S33균주는 325㎎%와 C06S05×C06S43균주는 280㎎%로 조사되었다. 이 후 C06S05×C06S33균주와 C06S05×C06S43균주를 각각 배양하여 동일한 특성이 유지되는 것을 확인하였다.

선발된 균주는 국립종자관리소에 2007년 03월 23일자로 품종명칭 예당3호로서 품종보호출원(출원번호 출원 2007-125)을 하였다.

< 실시예 5> 최적 균사배양온도 조사

　　　　　　　　C06S05×C06S33균주를 YMA(yeast malt agar)배지에 접종하여　 15℃, 20℃, 25℃, 30℃, 35℃에서 15일간 배양한 후 균사생장을 조사하였다.　 20 ~ 25 ^oC 사이에서 성장이 양호하였으며 25℃에서 균사생장이 가장 양호하였다 (도 3).

도 1은 번데기동충하초로부터 분리한 단포자들 (C06S01, C06S02, C06S03, C06S04, C06S05)을 배양한 결과이다.

도 2는 C06S05×C06S33균주와 C06S05×C06S43균주의 배양결과이다.

도 3은 C06S05×C06S33균주의 배양온도에 따른 균사생장을 비교한 그래프이다.

Claims

(a) 동충하초의 자실체로부터 단포자를 분리하는 단계;

(b) 분리한 단포자들을 각각 배양하여 자실체를 유도하고, 자실체 형성능, 코디세핀함량 및 조합능력이 우수한 균주를 선발하는 단계;

(c) (b) 단계에서 선발된 균주의 포자를 다른 균주들의 포자와 조합배양하여 자실체 형성능 및 코디세핀 함량이 높은 동충하초균을 선발하는 단계를 포함하는 동충하초로부터 고함량의 코디세핀을 안정적으로 생산하는 방법.
제1항에 있어서, 동충하초가 번데기 동충하초인 방법.
제1항에 있어서, 동충하초의 배양온도를 20~25^oC로 유지하는 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 방법에 의하여 생산되며, 국립종자관리소에 품종보호출원(출원번호 출원2007-125)된 번데기동충하초.