KR100758813B1 - 동충하초 감염 번데기의 장기보존방법 및 균 재생방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동충하초에 감염된 누에번데기의 체내 수분을 적정수준으로 조절하여 일정온도에서 생장을 억제시킴으로써 장기간 보존이 가능하도록 하는 동충하초 감염 번데기의 보존 방법 및 보존된 번데기를 원하는 시기에 재생시켜 사용하는 재생 방법에 관한 것이다.

동충하초, 감염 번데기, 장기보존, 재생, 수분율, 자실체

Description

동충하초 감염 번데기의 장기보존방법 및 균 재생방법{Method for preserving and regenerating pupa infected by Cordyceps spp, entomopathogenic fungi}

도 1은 본 발명에 의한 동충하초 감염 번데기의 보존 및 재생 과정을 보여주는 흐름도이다.

도 2는 동충하초 감염번데기 단면으로 체내 수분제거로 충체가 수축되면서 생장 정지된 조직을 보여준다.

도 3은 동충하초 감염번데기 단면으로 전처리(수분첨가)에 의해 충체가 팽창 복원된 조직을 보여준다.

도 4는 번데기 장기보존 후 재생처리에 의해 정상적으로 생장된 자실체 사진이다.

본 발명은 동충하초에 감염된 누에번데기의 체내 수분을 적정수준으로 조절하여 일정온도에서 생장을 억제시킴으로써 장기간 보존이 가능하도록 하는 동충하 초 감염 번데기의 보존 방법 및 보존된 번데기를 원하는 시기에 재생시켜 사용하는 재생 방법에 관한 것이다.

누에유충기에 동충하초 균이 접종된 감염번데기에 있어서 현재까지의 기술로는 생장을 억제할 수 있는 방법이 없었으므로, 농가에서는 예측되는 수요량을 불문하고 획일적으로 생산할 수 밖에 없는 실정이었다. 이것은 농가의 노동력과 노동시간을 집중시키고, 재배 후에도 생산 물량이 동시에 방출되어 가격하락 및 재고량 증가 등으로 인하여 농가에 심각한 문제로 제기되어 왔다.

이에 본 발명자들은 동충하초가 접종된 감염 번데기의 생장을 억제시키기 위하여 일정온도 하에 저장하여 장기 보존할 수 있는 기술을 연구한 결과, 생산물의 보존을 위해 필요한 동결건조기 등의 고가장비 및 전문기술이 불필요할 뿐만 아니라, 보존된 번데기를 원하는 시기에 꺼내서 자실체를 생산하여 소비자의 수요 요청 시기에 맞추어 탄력적으로 생산, 공급할 수 있는 기술을 확립함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 동충하초 감염 번데기의 장기간 보존방법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명의 목적은 상기 보존된 동충하초 감염 번데기를 원하는 시기에 꺼내어 자실체를 생산해 낼 수 있도록 재생시키는 방법에 관한 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 동충하초에 감염된 누에번데기의 생장억제를 위하여 체내수분을 탈수하여 저장고에 보존한 후 재배시험에 사용하였으며 이러한 전 과정을 도 1에 도시하였다.

도 1에 도시된 본 발명에 의한 동충하초 감염 누에 번데기의 보존 및 재생 과정을 보다 상세히 설명한다.

먼저, 동충하초를 접종한 감염 번데기를 준비한다. 감염 번데기의 체내 수분율을 4% 수준으로 조정한 후 저장온도를 4, -20, -70℃ 및 동결건조한 다음 -70℃에서 보관한 후 원하는 시기에 균 재생 처리를 한다.

상기 보존된 번데기의 재생은 번데기 충체 내 수분을 재침투시켜 복원하는 과정으로서, 상기 번데기를 증류수에 1-3 시간동안 침지시키는 전처리 과정을 거침으로써 동충하초 발아 및 자실체 발생에 효과적이었다.

감염번데기의 최장 보존기간은 수분율 4%, 저장온도 4℃ 이하에서 135일간 안정적 보존이 가능하였으며, 재생율도 약 97%에 달하였다. 또한 냉동 보존에는 온도가 낮을수록 보존기간은 연장되었고, 동결건조 후 -70℃ 이하 저장 시에는 1년까지 생존이 가능하였다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 보다 자세하게 설명한다. 그러한 이런한 실시예들은 본 발명을 구체적으로 설명하려는 것이지, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

[실시예 1] 동충하초 감염 번데기의 보존

남 등(1999)의 방법에 따라 살아있는 누에에 동충하초 균을 접종한 후 감염된 번데기는 고치에 피막된 상태로 각각 시험에 사용하였다(남성희· 조세연, 정이연, 지상덕 (1999) 눈꽃동충하초의 형태 및 배양조건, Kor. J. Seric. Sci. 41(1) : 36-40).

공정 1) 체내 수분율 조정 및 번데기 보존온도별 균 재생

상기 누에번데기를 수거하여, 고치 상태로 온도 20℃ 내외의 실내에서 음건하여 수분을 제거하였으며 각각 수분율은 표 1에 나타내었다. 번데기 체내 수분율은 상족 후 14일 경과시 25∼29% 범위이며, 이때 번데기 표피는 눌렀을 때 다소 무르다. 체내 수분율 4%는 개체가 외부압력에 의해서도 잘 부서지지 않으며 외형주름이 매우 심하고, 표피와 내부조직 등이 돌과 같이 단단한 극한의 경우이다.

탈수된 번데기는 온도별 처리구에 의거 14일간 정치 보존하였으며, 그 후 증류수로 수분 재 침투 후 재배하였고 자실체 발생을 조사하여 균 재생 여부를 판단하였다. 표 1에서 온도 22℃ 처리구는 대조구이며 30일 보존기간을 두지 않고 즉시 재배하는 관행의 방법이다. 시험 결과 감염 번데기는 수분율 4%일 경우는 4, -20, -70℃ 및 동결건조 상태 보관 후 전 처리에 의해 자실체 유발이 가능하였으며, 체내 수분율이 10% 이상인 상태에서 -20℃ 이하로 보존한 경우에는 동일한 재생 처리법에도 균 재생이 불가능하였다. 이것은 감염 번데기 체내 균사가 급속동결시 응결 과정에서 균사 및 균사체의 막과 핵 등의 구조물에 손상을 받은 것으로 판단된다.

특히 체내 수분율이 4%로 유지되었더라도 보존온도 10℃ 범위인 경우는 보존기간 동안 일부 번데기의 표면상에 균사가 증식하여 안정적 보존이 어려웠는데, 그 원인은 고치 속 혹은 보존실 내의 공기접촉에 의해 수분율이 증가한 것으로 생각된다.

따라서, 본 시험에서는 번데기 체내 수분율이 4% 일 때 보존온도가 4, -20℃, -70℃ 및 동결건조 처리에 의해 번데기 체내 균사생장이 완전정지하고, 다시 균 재생처리에 의해 생장이 재현되는 안정적 보존이 가능하였다.

[표 1]

체내 수분율 및 보존온도별 번데기 보존 후 재생 효과 (100두 3반복)

처리온도(℃) 수분율(%)	동결건조	-70	-20	4	10	22
4±1	o	o	o	o	△	△
10±1	-	-	-	△	△	△
20±1	-	-	-	△	△	△
25±1	-	-	-	△	△	△

* o : 자실체 발생하고 저장 중 균사체가 표피에 전혀 발생하지 않은 안정적 상태

△ : 자실체 발생하나 저장 중 균사체 표피에 일부 발생하였거나, 저장 불능상태

- : 자실체 미발생

[실시예 2] 장기보존 번데기의 재생 처리 후 재배특성 조사

동충하초 감염 번데기를 상기 실시예 1에서 설정한 보존 조건을 토대로 장기 보존한 후, 재생된 균의 배양특성을 조사하였다. 감염번데기는 4℃에서 90일간 정치하였다. 저장고에서 보존된 감염번데기로부터 저장기간 동안 오염율을 조사한 결과, 번데기의 오염은 체내 수분율이 높을수록 증가하였는데, 수분율 4%에서는 오염율이 1%이었으며, 수분율 20% 이상에서는 급속히 증가하였고 25%일 때는 오염율이 12%에 달하였다. 저장기간 동안 번데기를 싸고 있는 고치의 기능은 번데기 체내수분이 낮은 경우는 외부로부터 번데기를 격리하여 안전하게 보호기능을 하지만, 수분율이 20% 이상으로 높은 경우는 보습작용으로 2차 오염원 유발을 촉진하여 안정보존을 저해하는 것으로 보인다.

[실시예 3] 장기보존 번데기에 전처리 과정을 거친 후 재생시킨 다음 재배특성 조사

동충하초 감염 번데기를 상기 실시예 1에서 설정한 보존 조건을 토대로 장기보존한 후 재배 직전의 감염번데기를 증류수에 침지하여 체내의 수분을 정상수준으로 복원하는 전처리 과정을 거쳐서 재생시켰다. 시험구에 따라 전처리 소요시간을 1시간 혹은 3시간으로 설정하였다. 수분율 10%인 경우는 3시간동안 전처리 과정을 거치자 완전복원이 가능하였고, 초기발아 및 자실체 무게 등이 정상적 수준이었으며, 1시간 전처리 시에는 감염 번데기가 다소 딱딱하고 초기발아가 96시간으로 지연되며, 자실체 생산량도 다소 저하되었다. 수분율이 20% 이상인 경우는 1시간 전처리로 복원되었으나, 3시간 전처리 시에는 과수분 상태로 번데기가 물러지고 배양 시 자실체가 썩어 발생하여 재배는 불가능하였다. 따라서, 수분율 4%로 최소화한 상태로 보존 시에는 오염율도 최소화 할 수 있으며, 재생 시에는 3시간 전처리가 적합한 것으로 확인되었다.

[표 2]

감염번데기 수분율 별 4℃ 보존 처리시 감염번데기의 재배특성 (4℃, 90일 보존, 100두 3반복)

특성 수분율(%)	오염율(1)(%)	전처리(2)(hr)	초기발아(3)(hr)	자실체 무게(4)(mg)
4±1	1±1	3	72	12.0±0.2
		1	96	10.0±1.5
10±1	4±2	3	72	13.2±2.2
		1	96	10.1±1.7
20±1	9.3±1.1	1	72	13.0±1.9
25±1	12±1	1	72	12.3±1.5

(1) 오염율 : 고치를 잘랐을 때 기타 균에 의해 감염된 상태

(2) 전처리 : 보존 후 배양직전 증류수에 침지하여 정상수분 상태로 현재의 상태인 25-28%로 복원하는 과정으로 손으로 눌렀을 때 수분이 약간 배어 나오는 무른 상태

(3) 초기발아 : 90% 이상의 감염번데기에 표면균사가 덮이기 시작하는 시기

(4) 자실체 무게 : 재배 후 배양된 동충하초의 개체당 무게

[실시예 4] 동충하초 감염 번데기의 최장 보존기간 조사

동충하초 감염 번데기의 보존에 최장기간을 조사하기 위하여 체내 수분율 4%로 조절한 후 온도별로 보관하였다. 6개 처리구는 동결건조, -70, -20, 4, 10 및 대조구 22℃이며, 22℃ 처리구를 제외한 5개 구에서는 15일 간격으로 배양하여 감염 번데기의 보존력, 오염율을 조사하였다. 표 3에서 기재된 보존기간은 균 발아율 10%, 오염율 10% 및 자실체 미발생율 10% 미만인 경우를 허용범위로 하였으며, 재생율은 최장 보존 기간일에 조사된 자실체 형성율을 기준으로 하였다. 22℃ 처리구는 지속적으로 균의 건조 등으로 3일 이상 보존이 어려웠다. 기타 5개 시험구에서는 균 재생시험 결과 자실체 발아가 대체로 양호하였으며 4℃ 저장의 경우는 135 일간 저장이 가능하며 재생율도 약 97%에 달하였다. 냉동처리의 경우는 온도가 낮을 수 록 보존기간은 연장되었고, 동결건조 후 -70℃ 하 저장시에는 1년까지 생존이 가능한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 기존에 균사체 혹은 균핵 상태의 진균 보존이 어려운 것으로 알려진 사실과 달리 매우 안정적인 보존이 가능한 결과이며 추후 유사 균종에도 장기보존 기술로 적용이 가능할 것으로 판단된다. 따라서 장비유지비 등의 경제성을 고려했을 때 4℃ 저장시는 보존율, 재배상태, 저장성 및 보존기간에서 매우 효율적일 것으로 판단되며, 추후 유전자원의 영구적 보존 등의 목적으로 이용 시에는 동결건조 후 보존하는 경우 매우 유용한 기법으로 발전 보완 가능할 것으로 보인다.

[표 3]

온도별 처리조건에 따른 감염번데기의 보존기간 (수분율 4%, 100두 3반복)

특 성 처리온도(℃)	보존기간(1)	재생율(2)
동결건조	365일	97.3±2.5
-70℃	165일	95.0±2.6
-20℃	165일	96.0±1.0
4℃	135일	97.0±1.0
10℃	60일	91.3±3.5
대조(22℃)	3일	100

가. 동충하초 재배용 감염번데기의 장기보존 기술은 현재까지 개발되지 않은 매우 획기적인 균 보존 기술로써,

나. 동충하초 균의 안정적 보존을 통해 유용자원의 보존방법이 다양해짐으로써 자원의 활용가치를 확대할 수 있다.

다. 번데기가 함유한 체내 수분율을 적절히 제어를 함으로써, 60일 ∼ 1년 까지 안정적으로 보존할 수 있고, 기존의 생산물 보존을 위해 요구되는 고가장비 및 고도기술이 생략가능하다.

라. 또한 필요로 하는 시기동안 안정적 보존이 가능하여 재배시기 집중, 생산량의 과잉, 재고 등의 어려움을 없앨 수 있다.

마. 본 기술에 의해 보존된 감염번데기를 이용, 재배하는 농가는 생산물의 출하시기를 자유자재로 조절함으로써 비생산기에도 고가의 동충하초를 생산하여 부가가치를 높일 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에서는 동충하초 감염 번데기의 체내수분을 일정수준으로 제거함에 따라 균 생장을 안전하게 정지시킬 수 있었고, 기존에 균 보존을 위해 사용되어 온 고가장비 및 고도기술이 불필요하며 유지비용도 획기적으로 줄일 수 있었다. 또한 시기적으로 임의 재생이 가능하여 동충하초 재배시기가 자율적으로 조절 가능해 짐으로써 생산시기 집중, 생산량의 과잉 및 재고 등의 농가 경영상 어려움을 해소할 수 있었다.

특히 본 발명은 동충하초 자원보존을 위한 진균보존 기술로도 이용이 가능할 뿐만 아니라 다회 계대로 인해 발생될 수 있는 동충하초 종균의 병원력 감소 및 2차 오염 해소하는 데에도 유용한 기술로 확인되었다.

Claims (2)

1. 동충하초 감염 번데기를 고치 상태로 20℃의 실내에서 음건하여 수분율 4%로 조절하고 4℃ 이하에서 보존하는 방법.
2. 제 1항에 의하여 보존된 동충하초 감염 번데기를 증류수에 1-3시간 침지시킨 후 재생시키는 방법.

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