지난 포스팅에 백강균 전반에 관한 내용을 정리하였어요.
그에 이어 오늘은 백강균의 배양을 위한 배지 만드는 법과 배양 환경에 관한 내용을 정리하려고 합니다.
농업비용을 줄이는데 도움이 될 수 있으면 좋겠다는 뜻을 가지고 글을 정리하면서도 한가지 조심스러운 것은 배양 조건에 맞추어 자가 배양을 한다고 하더라도 그 결과를 확인할 수 있는 방법이 없다는 점이예요.
자가배양한 배양액에 포함된 균종을 확인하는 것을 지원하는 농업기술센터가 현재 없거나 많지 않은 것으로 저는 알고 있어요.
다만, 백강균을 비롯한 동충하초균은 자연 상태에서도 배양이 되고 증식이 된다는 점을 감안했을때, 우리가 백강균이 포함된 농자재나 원균을 구하여서, 실험실과 꼭 같은 환경은 아니더라도 백강균의 생육 조건에 맞추어 배양을 한다면 어느 정도 증식된 백강균을 활용할 수 있지 않을까합니다.
시판되는 천연 방제제의 가격은 고가이니, 자가 배양을 해낼 수 있다면 시판 농자재에 비해 부족한대로 사용은 가능하리라 생각해요.
미생물과 균들은 언제나 자신의 생육 조건에 맞기만 한다면 증식을 해서 개체수를 늘리는 습성을 가지고 있으니까요...
백강균 현미경 확대사진과 배양 모습입니다.
(왼쪽 이미지출처: https://images.app.goo.gl/rqYs7j4FehnCHxbx8, 오른쪽 이미지 출처 : https://images.app.goo.gl/ejHumGDyY2vCrEKB8)
우선, 백강균은 동충하초의 일종이므로 동충하초 재배법에서 찾을 수 있는 배지 만드는 법을 제일 먼저 소개드립니다.
무엇보다 감자배지는 우리도 쉽게 구할 수 있는 재료이기 때문에 응용이 쉬울 것이라 생각되어져서입니다.
■ 동충하초 재배기술
감자 한천배지는 물 1000ml에 감자 200g을 넣어 끓여 설탕 18g, 한천 18g을 넣어 제조합니다. 이것에 원균을 이식시킨 후 25°C 에서 7일간 배양하면 된다고 합니다.
액체 배양도 가능한데 역시 1000ml의 물에 한천을 빼고 감자 200g을 끓인 후 설탕 18g을 넣어서 만듭니다.
개개 농가에서 자가 배양을 할 경우 실험실처럼 이 배지를 121°C 에서 20분간 고압살균을 하여 멸균과정을 거칠 수는 없을 것이나, 100°C 까지의 가열 소독은 가능하고, 무엇보다 액체 배양이 가능하다는 근거가 되는 자료입니다.
자연상태에서 동충하초의 증식이 활발한 때는 5월 하순부터 10월 하순까지, 특히 장마철 전후라고 하니 그 즈음이 자가배양시기로 적기라는 생각이 들어요.
건조현미를 하루동안 물에 담그어 물에서 건진 후 번데기와 현미를 섞어 전체 습도를 75%정도로 맞추어 곡물배지를 만드는 방법도 있다고 합니다.
외국자료에서는 수수나 엿기름 추출물을 이용해 배양을 하는 경우도 보았어요.
수수는 24시간 이상 물에 불려 사용을 하는데, 엿기름 추출물은 미강 추출물의 방법을 응용하여 엿기름 1 : 물 9의 비율로 삶아서 사용하시면 되지않을까 생각해봅니다.
수수배지는 하단 참고문헌에 링크를 걸어두었습니다.
어떤 배지를 사용하시건 배양실은 어둡게 하여 암배양을 하는 것이 좋으며 온도는 25°C, 습도는 70~80%를 유지하는 것이 좋다고 합니다.
■ 미강추출물을 이용한 곤충병원성 곰팡이 Beauveria bassiana의 최적 배양 조건 및 효소활성
두번째 방법은 미강추출물을 이용해 만든 배지 ERBM에 0.5% 황산암모늄을 첨가하여 산도 pH 5, 28°C에서 배양이 잘 되었다고 하네요. 황산암모늄은 유안비료 성분이라고 해요.
특히, 미강은 농가에서도 쉽게 구할 수 있는 것이니 응용이 가능하다고 생각하여 적어놓습니다.
위의 연구는 안동대에서 진행된 것인데, 출원자는 다르나 미강추출물이 포함된 배지를 사용하여 특허를 받은 것이 있어 이어서 함께 내용 정리해봅니다.
■ 곤충병원성 곰팡이균 포자형성 향상을 위한 액체배지 조성물 및 배양방법 (Culture method for improving spore formation of Beauveria bassiana)
포도당, 이스트 추출물, 황산 마그네슘 7수화물, 인산칼륨으로 만들어진 GYMK 배지, 미강과 물을 1: 9로 하여 15분간 121°C에서 멸균하여 추출한 추출액 ERBM, 황산암모늄에서 백강균을 pH 5, 25°C 배양시 포자 형성도가 높았다고 합니다. GYMK 배지와 2% 글리세롤을 첨가하는 것이 균의 성장에 안정적이라는 사실이 위의 논문에서 추가된 듯이 보이네요.
글리세린은 글리세롤이 95%이상 포함된 물질이고 약국에서 쉽게 구입이 가능해요. 말통 (20L)에 0.2%는 40ml로 아주 적은 양을 사용하면 될 듯 합니다.
위의 논문과 특허내용 두가지 모두에서 미강추출물이 백강균 배양에 도움이 된다는 것을 찾아볼 수 있어요.
■ 백강균 (Beauveria bassiana)의 균사체 최적 배양조건 및 효소 활성
네번째 방법은 버섯 완전배지 MCM을 이용하여 pH 7, 24°C에서 가장 우수한 생육결과를 얻어낸 것인데요,
버섯 배지 (MCM)의 제조 방법은 아래와 같습니다.
인산칼륨 2종 중 일인산칼륨(KH2PO4)은 산성이고, 이인산칼륨은 알카리입니다. 이 두가지를 섞어 원하는 산도를 맞추는데 사용하는 거예요. (이미지 출처 : 버섯완전배지(MCM)와 버섯최소배지(MMM) 구성원소 http://naver.me/FVPh8kfi)
이 논문에서 제가 주목한 것은 카제인과 수용성 키토산을 첨가할 경우 단백질 분해효소인 프로테아제와 키틴질 분해효소인 키티나제 효소 활성이 증가 되었다는 점이예요. 프로테아제와 키티나제는 곤충들 내부의 단백질과 곤충들 외벽을 싸고 있는 키틴질을 더 쉽게 분해하게하여 백강균의 증식에 도움이 되어줄 거예요.
효소 활성을 증가시키는 카제인은 우유의 주 단백질 성분이므로 농가에서는 탈지분유 등을 활용하여 대체할 수 있을 거라는 생각을 해보았습니다. 탈지분유에 함유된 단백질 함량은 35%임을 확인하였습니다.
동충하초를 배양하는 곡물배지에 백미 80: 분유 20의 비율로 사용하는 예를 첫번째 동충하초 재배기술 자료에서도 볼 수 있었어요.
키틴은 게, 가재, 새우와 같은 갑각류에 많이 포함되어 있습니다.
펩톤은 균배양시 아미노산의 역할을 하므로 아미노산으로 대체 가능하다고 생각을 했는데, 자료 확인을 해보니 농업용 아미노산의 아미노산 함량은 높아야 50%, 나머지 50% 성분이 무엇인지 명기되어있는 것이 없네요.
즉, 펩톤과 아미노산을 동량으로 치환해 배양을 할 경우, 기대하는 결과와는 다르게 나타나는 부분이 있음을 확인하였습니다. 농업용 아미노산은 제조사의 제조과정에 따라 산성을 띤다고 하니 사용하실땐 산도를 꼭 확인하시고 사용을 하세요.
아래 자료에서 백강균은 pH 4에서 잘 자란다고 하니, 산성인 농업용 아미노산을 사용하신다면, 배양액의 pH를 맞추는데에 유리한 점은 있는듯 합니다.
산성인 인산가리에 알카리인 이인산가리를 넣어주면서 pH 6으로 산도 조절을 해주는 방법입니다. 산성인 인산가리는 우리가 비료로 쉽게 구입할 수 있어요. (이미지 출처 : 인산염완충액 pH6.0 제조방법 캡쳐 http://naver.me/FlYfEhvf)
배지에 사용된 인산칼륨 2종은 산도 조절을 위해 넣어준 거예요. 제 1인산칼륨 (KH2PO4 인산이수소칼륨, 인산가리)은 산성이고, 제 2인산칼륨(K2HPO4 이인산가리) 은 pH 8.3~9.3알카리성입니다. 두가지를 섞어 원하는 산도를 맞추어준 것이죠. 우리가 흔하게 비료로 사용하는 인산가리는 일인산칼륨으로 산도가 pH 4.2~4.7 이라고 합니다. 산성인 pH를 맞추는데 도움이 될 듯 합니다.
■ 두부제조시 발생되는 폐비지를 이용한 백강균 배양방법 ( The culture method of Beauveria bassiana using the waste bean curd produced from the process of bean-curd industries)
마지막으로 소개드리는 방법은 백강균 배양에 관련해 특허를 신청했다가 거절을 받은 배양방법이예요.
그래도 주변에서 쉽게 구할 수 있는 재료들로 배양을 하고 있어서, 그 효율은 떨어질지 모르나 참고될 부분이 있을까 싶어서 적어놓습니다.
흔하게 미생물 배양에 사용되는 감자 포도당 배지(Potato Dextrose medium) 대신 두부를 만들고 남은 비지를 사용했다고해요. 소량으로 만들어 볼 경우 두부로 대체하여 만들어 볼 수도 있을 것 같아요.
비지를 전체 배양액 총량의 10~20%를 사용하였고, 15%일 경우 최고의 배양 효과를 보여주었다고 합니다.
산도를 pH 4일때 가장 잘 자란다는 것이 인상적인데요,
산도조절을 위해 인산염 완충액과 시트르산(구연산) 완충액을 사용했다고 해요.
인산염과 시트르산 완충액에 관해 찾아보니 인산염과 시트르산 모두 산성이라 산도조절제로 자주 사용된다고 합니다.
골분을 산에 녹인 것을 인산염 대용으로 사용해볼 수 있겠다고는 생각을 해보나 산도를 맞추기위한 양을 가늠하기 쉽지 않아서 백강균 자가배양에 사용하려면 번거로움이 동반되겠다는 생각을 했습니다.
인산염을 대신할 수 있는 인산가리의 산도는 위에 올려드렸고, 우리가 쉽게 구할 수 있는 구연산의 사용량을 계산할 수 있는 근거가 될만한 내용을 다행히 찾을 수 있어 함께 올려 놓습니다. 희석비율에 따른 무수구연산의 pH 농도는 1%일 경우 pH 2.25, 5% pH 1.87, 10% pH 1.68, 70% pH 0.39라고 합니다.
산도조절을 위한 구연산 용액의 산도를 측정하신 후 넣으실 양을 어느 정도 가늠하여 투입하시고 배양액의 산도를 측정하시면 수월하실듯 해요.
'분생포자 형성균 배양용 배지의 제조방법 (Meduim for culturing condiophores formable bacillus)' 특허 내용은 분생포자로 번식하는 백강균의 배양배지로도 활용이 가능할 것이라 생각되어요.
다만, '사상균 처리'라고만 표현된 부분에 대해 사상균으로 난분해성 섬유소를 분해시킨다는 것은 버섯균을 이용한 발효과정과 관계가 있고 톱밥 등의 섬유소가 많이 함유된 배지를 사용할 것이라는 추측은 가능하나 구체적인 방법에 대한 표기가 없어 내용 소개에만 그치려 합니다.
이외에 누에 번데기나 장수풍뎅이를 배지로 삼아 백강균을 배양하는 특허들을 볼 수 있었는데 이것들은 보통의 농가에서 구하기 어려운 재료들이라 누락시켰습니다.
저비용 고효율이라는 말 속에는 항상 보이지 않는 노동이라는 숨겨진 비용이 포함되어 있다는 생각을 합니다.
가급적 출처가 명확한 논문이나 특허받은 것을 위주로 자료를 찾아 올리기는 하였으나, 이 자료들을 바탕으로 배양을 해내는 것은 또 하나의 노동이며 비용이 될 수도 있다는 생각도 해보았어요...
백강균의 원종을 채집, 혹은 백강균이 포함된 농자재를 구입하는 것도 부담 중의 하나가 될 거예요.
그래도,
곰팡이들이 좋아하는 여러 종류의 다른 배지에서 백강균의 배양이 가능하다는 것과 백강균이 산성에서 배양이 잘 된다는 점은 자가배양에 청신호인듯해요.
곰팡이 배양에 좋은 주재료인 곡물과 어분 등을 주변에서 구할 수 있는 것들을 활용해 배양액 재료를 준비하면 좋을듯해요.
또, 백강균 배양에 적절한 산도를 맞추어 주었을때, 산성에 강한 유산균, 효모균을 제외한 다른 균들의 배양은 억제된다는 것을 의미하므로 실험실만큼 순도와 밀도가 높지는 않겠지만 충분히 자가배양도 가능하다는 생각을 해요.
혐기성균인 유산균, 그리고 유산균의 분해물을 이용해 증식하는 효모균의 증식을 억제하기 위해서 기포기 사용이나 하루에 한 번 이상 저어주기 등을 하여 호기 조건을 만들어주는 것이 더 좋을듯 합니다.
새로운 것에 도전하는 여러분의 노동이 한편 즐거움도 되는 일이길 기원드리며 글 줄입니다.
늘 건강하세요~!
□ 이 글을 작성하며 도움을 얻은 여러분들의 글입니다. 감사의 마음 함께 전해드립니다.
○ 동충하초 재배를 위한 감자한천배지, 감자설탕배지, 곡물배지 만드는법, 25°C, 습도 70~80% / 곡물배지에 20%의 분유를 사용한 예 : (재배기술)동충하초 재배기술 - 농업
http://me2.do/G1L2ecR8
○ 미강배지, 산도 pH 5, 28°C를 이용한 백강균 배양 : 미강추출물을 이용한 곤충병원성 곰팡이 Beauveria bassiana의 최적 배양조건 및 효소활성 / 한국생명과학회 생명과학회지 / 김창수(안동대학교 생명자원과학과); 이중복(안동대학교 생명자원과학과); 김범수(안동대학교 생명자원과학과); 이민혜(안동대학교 생명자원과학과); 강경묵(안동대학교 생명자원과학과); 주우홍(창원대학교 생물학과); 김진원(예천군 농업기술센터); 임대준(예천군 농업기술센터); 권기석(안동대학교 생명자원과학과) [한국전통지식포탈-논문]
http://me2.do/FV9jOEY0
○ (NH4)2SO4 황산암모늄 화학식
출처 : 네이버 지식iN
http://naver.me/xLRFqMxQ
○ 유안 비료의 주성분은 황산암모늄이다. : 유안(황산암모늄) 비료
http://me2.do/xDAMJ2Z5
○ 포도당, 이스트 추출물을 이용한 배지와 미강추출물을 사용한 특허 받은 동충하초류 배양법, 산도 pH 5, 25°C : KIPRIS 특허정보 검색서비스 곤충병원성 곰팡이균 포자형성 향상을 위한 액체배지 조성물 및 배양방법 (Culture method for improving spore formation of Beauveria bassiana)
http://me2.do/xhOgAFd1
○ MgSO4•7H2O 황산마그네슘 7수화물은 황산염, 또는 엡손염이라고도 불린다 : 20년 농사 준비 http://naver.me/Gs3GEDzN
○ MgSO4•7H2O 황산마그네슘 7수화물은 사리염이라고도 불린다.
○ K2PO4는 인산칼륨 : KH2PO4나 K2HPO4 차이
http://naver.me/56eavuUk
○ 글리세린은 글리세롤이 95%이상 함유된 물질이다 : 글리세롤 / 글리세린은 우리 피부에 왜 좋을까? https://m.blog.naver.com/kimstar11111/221293612020
○ 글리세린과 글리세롤의 차이 : 글리세린? 글리세롤 https://m.blog.naver.com/giajane/221536376654
○ 버섯배지, pH 7, 24°C : 백강균 (Beauveria bassiana)의 균사체 최적 배양조건 및 효소 활성 https://www.kci.go.kr/kciportal/ci/sereArticleSearch/ciSereArtiView.kci?sereArticleSearchBean.artiId=ART000997664
○ 버섯 완전배지 (MCM) 제조법 : 버섯완전배지(MCM)와 버섯최소배지(MMM) 구성원소
http://naver.me/Gvr3vIkK
○ 버섯배지 제조 과정 : [실험기초] MCM 배지만들기, PDA 배지만들기 : 한국농수산대학 버섯학과, 버섯종균기능사 실기문제
http://naver.me/xaFhA1QC
○ 탈지분유에 함유된 단백질은 35%이다. :
우유 vs 전지분유 vs 탈지분유 비교 http://naver.me/FiWcT29A
○ 두부비지 15% 용액, pH 4, : 두부제조시 발생되는 폐비지를 이용한 백강균 배양방법 ( The culture method of Beauveria bassiana using the waste bean curd produced from the process of bean-curd industries) KIPRIS 특허정보 검색서비스
http://me2.do/Gcbw4asV
○ 인산염의 산도는 pH 2.8의 강산성 : 청량감 가득 탄산음료, 건강에는 꽝!
http://naver.me/5oOyyP2D
○ 구연산의 산도는 물에서 pH 3~6 사이 : 구연산은 어째서 ph를 조절시킬수 있나요?
출처 : 네이버 지식iN
http://naver.me/G3IpdESQ
○희석배율에 따른 무수구연산 pH 농도 1% pH 2.25, 5% pH 1.87, 10% pH 1.68, 70% pH 0.39
출처 : 네이버 지식iN
http://naver.me/G9AMGGg4
○ 물분자를 포함하는 함수구연산과 물분자가 없는 무수 구연산이 있다 : 시트르산 - 나무위키
http://me2.do/FHNtjnex
○ 사상균으로 난분해성 섬유소를 분해시켜 배지로 사용하는 방법 : 분생포자 형성균 배양용 배지의 제조방법 (Meduim for culturing condiophores formable bacillus)
KIPRIS 특허정보 검색서비스
http://me2.do/Ge8n3pP4
○ 누에번데기에 동충하초를 접종시켜 배양하는 방법 : KIPRIS 특허정보 검색서비스
http://me2.do/xQraot8b
○ 살아있는 장수풍뎅이에 동충하초균을 접종시켜 배양하는 방법 : KIPRIS 특허정보 검색서비스
http://me2.do/5yrO0svT
○ Beauveria Bassiana 배양이 가능한 배지는 감자 포도당 한천 (Potato Dextrose Agar) 뿐만이 아니라
포도당 펩톤 한천 (Glucose Peptone Agar),
몰트 추출물 펩톤 한천 (Malt extract Peptone Agar),
사브로드 포도당 한천 (Sabouraud Dextrose Agar)
등 다양하다.(외국 자료) - https://www.researchgate.net/post/Is_there_any_stranded_protocol_to_culture_beauveria_bassiana
○ 포도당, 펩톤, 카제인, 펩신 등이 포함된 사브로드 포도당 한천 배지
○ 보정살충율 계산 공식 : 2015년 1회 산림기사 산림보호학 기출문제 풀이(문12. 처리구의 보정살충율)
http://naver.me/xUoClUcP
○ 백강균에 감염된 개미는 과산화수소가 포함된 것을 찾아 섭취한다. : 균에 감염된 개미, 자가 치유할 줄 안다. http://m.seoul.co.kr/news/newsView.php?cp=nownews&id=20150824601012&rftime=20150630&refer=https://m.blog.naver.com/PostView.nhn?blogId=gg6710&logNo=220545022521&proxyReferer=http%3A%2F%2Fwww.google.com%2F
○ 백강균에 걸린 개미를 동료개미들이 핥아 면역체계를 만든다. : 개미도 사람처럼 백신을 맞는다
http://naver.me/564BX29y
○ 펩톤, 펩톤-포도당, 펩톤-포도당-이스트 추출물을 활용한 배지 중에서 펩톤-포도당 배지에서 백강균의 증식이 가장 활발했으나, 바이오매스(화학적 에너지로 사용가능한 식물, 동물, 미생물)의 함량은 펩톤-포도당-이스트 추출물 배지에서 가장 많았다는 연구의 요약본 (외국 자료) : Development of the entomopathogenic fungus Beauveria bassiana in liquid cultures | SpringerLink - https://link.springer.com/article/10.1007/BF00436909
○ 곡물인 수수를 사용하여 배양배지를 만드는 방법 (외국 자료) : Mass production of Beauveria bassiana (white muscardine fungus) — Vikaspedia - https://vikaspedia.in/agriculture/agri-inputs/bio-inputs/production-of-ipm-inputs/biopesticides/mass-production-of-beauveria-bassiana-white-muscardine-fungus